【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 著 PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性 。引物 5′端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合 DNA 序列；引入突變位點(diǎn)、插入與缺失突變序列和引入一啟動(dòng)子序列等。 若在 cDNA序列內(nèi)找尋 PCR引物，需特別注意兩點(diǎn)： ⑴ 盡力將引物和產(chǎn)物保持在 mRNA的編碼區(qū)域內(nèi)，因?yàn)檫@是生成蛋白質(zhì)的獨(dú)特序列，不像 339。末端非編碼區(qū)域與許多其它mRNA有同源性； ⑵ 盡力把引物放到不同的外顯子上，以便使 RNA特異的 PCR產(chǎn)物與從污染 DNA中產(chǎn)生的產(chǎn)物在大小上相區(qū)別。如果 PCR引物必須在特異序列的限定區(qū)域內(nèi)選擇，應(yīng)挑選缺乏 單一核苷酸的區(qū)域，這樣可以減少?gòu)V范圍引物 引物同源的機(jī)會(huì)。同樣也要注意引物對(duì)在長(zhǎng)度和 GC 含量上取得平衡以便使兩個(gè)引物的 Tm 值相差在23℃ 范圍內(nèi)。 ，其序列內(nèi)可能包含有引物內(nèi)所設(shè)計(jì)利用的酶切位點(diǎn)，可采用識(shí)別 8 個(gè)堿基序列的內(nèi)切酶 (Asc I, Not I, Pac I, Pme I, Sfi I, SgrA I,Srf I,Sse8387 I, Swa I)予以解決。 13．設(shè)計(jì)引物內(nèi)的酶切位點(diǎn)靠近 DNA末端時(shí)，要在引物的 539。端額外加入幾個(gè)堿基，便如 HpaII 和 MboI，要求在 限制性序列位于 539。末端前至少有一個(gè)堿基 (可參考1998/99New Engeand Biolabs Catalog 第 258頁(yè)所附的 Cleavage close to the end of DNA fragments(oligonucleotides)增加額外的堿基 )，否則將影響酶切效率。當(dāng)然，還有許多特殊目的的引物設(shè)計(jì)就需要按照所要達(dá)到的目的進(jìn)行不同的設(shè)計(jì)。總之，要掌握兩個(gè)目的的平衡：擴(kuò)增的特異性和擴(kuò)增的有效性。 實(shí)際擴(kuò)增時(shí)，引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是 PCR 失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容 易彌散的常見原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為： ① 選定一個(gè)好的引物合成單位。② 引物的濃度不僅要看 OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做 PCR 有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。 ③ 引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。 ***************************************************************************** 1 如何測(cè)定引物的 OD值？ 用紫外分光光度計(jì)在 260nm 波長(zhǎng)測(cè)定溶液的光密度來(lái)定量。請(qǐng)注意紫外分光光度計(jì)的使用，測(cè)定時(shí)溶液的光密度最好稀釋到 之間。 DNA干粉用一定體積的水充分振蕩溶解以后，取部分溶液稀釋到 1ml并在 1ml標(biāo)準(zhǔn)比色杯中測(cè)定其光密度，即為所測(cè)體積的 OD值，進(jìn)而可以計(jì)算出母液的 OD值。 2． 如何檢測(cè)引物的純度？ 實(shí)驗(yàn)室方便的作法是用 PAGE方法。使用加有 7M 尿 素的 16%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。取 ，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加熱變性 (95℃ ,2mins)。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。 600V 電壓進(jìn)行電泳，一定時(shí)間后 (約 23 小時(shí) )，剝膠，用熒光 TLC 板在紫外燈下檢測(cè)帶型，在主帶之下沒有雜帶，說明純度是好的。 3． 怎樣按照使用濃度溶解引物？ 記住幾個(gè)參數(shù)： 在 1ml體積 1cm光程標(biāo)準(zhǔn)比色皿中， 260nm波長(zhǎng)下吸光度為 1A260 的溶液定義為1 OD260 單位，據(jù)此定義， 1 OD260引物 干粉約為 33微克； 堿基的平均分子量為 ； 引物的分子量 =堿基數(shù) x 堿基的平均分子量； 引物的摩爾數(shù) =質(zhì)量數(shù) / 引物分子量 舉例：如果您拿到一管標(biāo)明為 2 OD的 20堿基的引物， 分子量 =20 x =6490 質(zhì)量數(shù) =2 x 33 =66μg 摩爾數(shù) =66 / 6490 = μmol= 10 nmol 若您需要溶解為 10μM(=10pmol/μl)的溶液，只需加 1mlddH2O充分溶解即可。 同時(shí)請(qǐng)您注意：真空干燥的 DNA呈干膜狀或粉末狀在離心管底部，開啟瓶蓋時(shí)小心不要丟失；請(qǐng) 加入足量的水充分振蕩溶解。 4． 如何保存引物？ 可以室溫或 20℃ 密閉長(zhǎng)期保存；溶解以后的 DNA 最好保存在 20℃ ,溶解引物的水的PH值要求大于 7，并且無(wú)菌。帶有熒光標(biāo)記的引物請(qǐng)注意避光保存。 5． 已經(jīng)溶解的引物，為什么原先使用正常，而過一段時(shí)間再使用就不好了？ 如果您溶解引物的水 PH 過低或污染了菌或核酸酶，會(huì)使引物降解。使用時(shí)沒有充分解凍振蕩混合，液體不均勻也可能會(huì)造成引物加入量不準(zhǔn)確。 6． 為什么說用 EB染色合成 DNA片段來(lái)定量是不正確的？ 通?？梢杂?EB染色的方法來(lái)判斷雙鏈 DNA的量 (如質(zhì)粒 DNA)，是因?yàn)?EB可以嵌合到雙鏈 DNA中。而合成的單鏈 DNA，由于堿基組成不同，形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能性不同，EB的染色程度也會(huì)不同，比如 Oligo(dT)等不形成二級(jí)結(jié)構(gòu)， EB根本無(wú)法染色。所以不要用 EB染色的方法來(lái)定量，而用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)。同樣道理，用 EB染色來(lái)照片不適合所有引物。 7．引物不純會(huì)造成什么后果？ 引物不純可能會(huì)導(dǎo)致： 1)非特異性擴(kuò)增； 2)無(wú)法用預(yù)先設(shè)計(jì)在引物 539。端酶切位點(diǎn)的酶切開，特別是沒有保護(hù)堿基的引物； 3)用于測(cè)序出現(xiàn)雙峰或亂峰。 8． 普通合成的 DNA片段 539。末端是磷酸基團(tuán)嗎？ 普通 合成的 DNA 片段 539。末端與 339。末端都是羥基，可直接用于 PCR。如果需要您可以用多核苷酸激酶進(jìn)行 539。端磷酸化，或者要求我們合成時(shí)直接在 539?；?339。端進(jìn)行磷酸化，需要另外收費(fèi) (參見價(jià)目表 )。 9. 常用標(biāo)記的熒光染料的波長(zhǎng)、可見光中的顏色 簡(jiǎn)稱 全稱 吸收波長(zhǎng) 發(fā)射波長(zhǎng) 顏色 6FAM 6carboxyfluorescein 494nm 518nm Green TET 5tetrachlorofluorescein 521nm 538nm Orange HEX 5hexachlorofluorescein 535nm 553nm Pink TAMRA tetramethyl6carboxyrhodamine 560nm 582nm Rose ROX 6carboxyxrhodamine 587nm 607nm Red Cy3 Indodicarbocyanine 552nm 570nm Red Cy5 Indodicarbocyanine 643nm 667nm Violet from: ********************************************************************** 計(jì) 算 機(jī) 輔 助 引 物 設(shè) 計(jì) from: 引物在 PCR 反應(yīng)中處于關(guān)鍵作用，引物決定著擴(kuò)增的特異性和擴(kuò)增的效率。而在目前DNA的化學(xué)合成技術(shù)非常成熟的情形下，引物設(shè)計(jì)是否合適是我們應(yīng)更為關(guān)注的層面?，F(xiàn)在有很多的免費(fèi)的軟件或網(wǎng)絡(luò)資源（ 行引物設(shè)計(jì)，這使我們總能找到適合我們自己應(yīng)用的引物設(shè)計(jì)工具。筆者用得較多的引物設(shè)計(jì)軟件有 oligo ( Primer premier 5 ([[/url] demo version)。需要說明的是經(jīng)過細(xì)致推敲和計(jì)算的引物并不能保證擴(kuò)增一定能夠成功或高效，但嚴(yán)密的設(shè)計(jì)并系統(tǒng)地考慮一些應(yīng)該避免的問題，能使我們?cè)诖蠖鄶?shù)情形下找到我們所需要的引物。 筆者接觸 PCR 較早，較多地從事引物設(shè)計(jì)也有一年多的時(shí)間，其間也得到過許多老師的幫助指教，現(xiàn)將一些體會(huì)整理出來(lái)，希望能對(duì)大家有一些幫助，同時(shí)也 盼望能得到更多的指點(diǎn)。 一，簡(jiǎn)單擴(kuò)增體系中引物設(shè)計(jì)原則。 簡(jiǎn)單體系，是指擴(kuò)增體系中模板較為單一且大部或全部模板序列已知，如經(jīng)過純化的短片段或純化后的重組質(zhì)粒等，是相對(duì)后面所提的復(fù)雜體系而言的一個(gè)粗略的分類。以下是一個(gè)大致的流程： 1， 考慮實(shí)驗(yàn)本身對(duì)這對(duì)引物的要求。如：待擴(kuò)增區(qū)域和擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度，擴(kuò)增產(chǎn)物是否需要考慮移碼突變，是否需要在引物 5’端引入酶切位點(diǎn)和引入哪些酶切位點(diǎn)，是否需要引入點(diǎn)突變， …… 依據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)而定。實(shí)際上，此步應(yīng)該是最費(fèi)時(shí)間和精力的一步。 2， 引物的 Tm 值。主要需要考慮的因素有： I, 反應(yīng)體系對(duì)引物退火溫度的影響；如酶的最適工作溫度對(duì)引物退火溫度的限制等。 II,擴(kuò)增產(chǎn)物的 Tm 值。引物和產(chǎn)物的 Tm值不要相差太大， 20 攝氏度范圍內(nèi)較好。定下引物的 Tm 值范圍之后即可定下引物的長(zhǎng)度范圍。 3， 引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)。包括引物自身二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物間二聚體等。這些因素會(huì)影響引物和模板的結(jié)合從而影響引物效率。對(duì)于 3’末端且 5’端突出的引物二聚體，應(yīng)控制其 ΔG大于 ，因?yàn)榇朔N情形的引物二聚體有進(jìn)一步形成更穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的可能性，引物中間或 5’端可適當(dāng)放寬。發(fā) 卡結(jié)構(gòu)也以 3’端或近 3’端對(duì)引物 模板結(jié)合影響更大，影響發(fā)卡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性的因素除了堿基互補(bǔ)配對(duì)的鍵能之外，與莖環(huán)結(jié)構(gòu)亦有很大的關(guān)系。應(yīng)盡量避免 3’末端有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的引物。 4， 擴(kuò)增的特異性。好的設(shè)計(jì)工具會(huì)提供一個(gè)引物異位引發(fā)的評(píng)價(jià)指標(biāo)，如 Oligo 的 false priming efficie