基于pcr的染色體步查技術(shù)(編輯修改稿)
2025-06-07 00:26 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 ns Kilstrup 進(jìn)一步改進(jìn)此方法 . 不要求接頭的兩條寡核苷酸鏈一長一短，而使接頭兩端均為 OH,不含磷酸基團(tuán)。 在第一個變性反應(yīng)時，和接頭引物配對的接頭寡核苷酸鏈會游離出來； 在第二個延伸反應(yīng)中 ,接頭引物才能以第一個反應(yīng)中延伸出的單鏈為模板開始擴(kuò)增 . A,B,C EcoRI酶切基因組的擴(kuò)增產(chǎn)物 D,E,F HindIII酶切基因組的擴(kuò)增產(chǎn)物 A,D 只加接頭引物 B,C,E,F 不同的特異引物和接頭引物 ?寡聚盒介導(dǎo)的 PCR 寡聚盒介導(dǎo) PCR是利用雙鏈接頭進(jìn)行染色體步行的方法，為了增加反應(yīng)的特異性他們在一個特異引物上增加了便于選擇特異產(chǎn)物的生物素標(biāo)記。 寡聚盒介導(dǎo) PCR在第一次 PCR反應(yīng)中用帶有生物素標(biāo)記的特異引物進(jìn)行單引物 PCR，合成含有目的序列和接頭序列的單鏈DNA產(chǎn)物，而后用鏈霉親和素覆蓋的磁珠在反應(yīng)混合物中捕捉分離帶有生物素標(biāo)記的單鏈產(chǎn)物，以回收的單鏈產(chǎn)物為模板用無標(biāo)記的嵌套特異引物和接頭引物進(jìn)行第二次 PCR擴(kuò)增，終產(chǎn)物純化后直接進(jìn)行測序。由于在特異引物上增加了有利于選擇特異產(chǎn)物的生物素標(biāo)記，這種技術(shù)的特異性比較高。 ?環(huán)狀 PCR 環(huán)狀 PCR是能夠根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)兩對嵌套 PCR引物進(jìn)行染色體步行的方法 。 包括 IPCR(Inverse PCR) PPCR(Panhandle PCR) IPCR與 PPCR的不同之處在于前者用 DNA連接酶使酶切片段自連產(chǎn)生環(huán)狀模板，而后者則利用末端反向重復(fù)序列與已知序列互補(bǔ)配對形成環(huán)狀單鏈模板。 IPCR (Inverse PCR) : ?基因組 DNA經(jīng)酶切后自連成環(huán)狀分子 。 ?再用另外一種限制性內(nèi)切酶在已知序列處切開，又成線狀 DNA。 ?根據(jù)兩端序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。 IPCR被用于從酵母基因組 DNA中分離 YAC克隆末端，也被成功的應(yīng)用于從植物基因組 DNA中分離轉(zhuǎn)座子側(cè)翼的特異區(qū)域。 主要缺點(diǎn) : 需控制酶切片段長度 ,長度太長會使擴(kuò)增效率下降 。
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