基于pcr的染色體步查技術(shù)-預(yù)覽頁
【正文】 用 PCR技術(shù)進(jìn)行染色體步行的關(guān)鍵在于 提供 PCR需要的另一個(gè)引物。 經(jīng)典的染色體步查方法比較煩瑣，適合于長距離步行，而基于PCR的染色體步行技術(shù)相對而言則比較簡便，適合于短距離步行。 在這種方法中，如果用合適的接頭代替載體效果也會(huì)一樣。 (1)選擇合適的酶切位點(diǎn)酶切總基因組； (2)用連接反應(yīng)將人工合成的接頭連接在酶切片斷兩端； (3)SPCR(suppression PCR) 所連接的雙鏈接頭是反向重復(fù)序列。vectorette’ 接頭由一條長鏈和一條短鏈組成 。 lane 2, primary PCR products from primers AP1 and P12。由于在特異引物上增加了有利于選擇特異產(chǎn)物的生物素標(biāo)記，這種技術(shù)的特異性比較高。 ?再用另外一種限制性內(nèi)切酶在已知序列處切開，又成線狀 DNA。 環(huán)化反應(yīng)難以控制，有線狀串聯(lián)體成為副產(chǎn)物甚至是主要產(chǎn)物，導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增 . PPCR (Panhandle PCR） 與 I－ PCR相比， P－ PCR是利用末端反向重復(fù)序列與已知序列互補(bǔ)配對形成環(huán)狀單鏈模板。 ) 在一系列不同的退火溫度下用特異性單引物 1分別進(jìn)行了 60個(gè)循環(huán)的 PCR，接著把在不同退火溫度下獲得的 PCR產(chǎn)物合并后用 特異引物 2作為測序引物共同進(jìn)行測序 。他們根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)設(shè)計(jì)了 TGW— PCR(Targeted Gene Walking PCR). 在 TGW— PCR中除了兩個(gè)特異性的嵌套引物外，還需要一組已知與模板 DNA有多個(gè)雜交位點(diǎn)的步查引物。 在利用特異引物和隨機(jī)引物進(jìn)行的 PCR中一般有 3種產(chǎn)物生成： ?由特異引物和隨機(jī)引物共同延伸產(chǎn)生的 I型產(chǎn)物 ?由特異引物單獨(dú)延伸生成的 II型產(chǎn)物 ?兩端由隨機(jī)引物延伸生成的 III型產(chǎn)物。這種策略的 關(guān)鍵 是 TAILPCR中使用的較長的高退火溫度的嵌套特異引物和較短的低退火溫度的隨機(jī)簡并引物，由于兩種引物的退火溫度有明顯的差異，這樣就可以通過控制 PCR循環(huán)中的退火溫度決定在 PCR反應(yīng)中何種引物能夠占優(yōu)勢，從而控制不同類型產(chǎn)物的
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