臺州市科技計(jì)劃項(xiàng)目可行性報(bào)告(編輯修改稿)
2024-10-08 19:26 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 實(shí)驗(yàn)主要儀器設(shè)備 暗房中的設(shè)備主要包括：熒光顯微鏡 1 臺、圖像采集分析系統(tǒng) 1 個(gè)、辦公電腦 1 臺；FISH 操作間主要的設(shè)備包括：普通光學(xué)顯微鏡 1 臺、 漩渦混合器 1臺、電熱恒溫培養(yǎng)箱 (42℃ )1臺、烤片機(jī) 1 臺、恒溫水浴箱 3 臺、迷你離心機(jī) 1 臺、 20℃冰箱 1 臺、 4℃冰箱 1 臺、 μ l 移液器 1 支、 l 移液器 1 支、 220μ l 移液器 1 支、 20200μ l 移液器 1 支、 2001000μ l 移液器 1 支。 實(shí)驗(yàn)所用耗材 實(shí)驗(yàn)耗材包括：載玻片、一次性手套、一次性口罩、吸水紙、玻璃刀、鉛筆、記號筆、鑷子、止血鉗、 EP 管、 10μ l 加樣頭、 20μ l 加樣頭、 1000μ l 加樣頭、醫(yī)療廢物盒、封口膜、15ml 離心管、立式染缸 (考普林瓶 )、 EP 管架、計(jì)時(shí)器、 水銀溫度計(jì)。 實(shí)驗(yàn)所用試劑及配制要求 20 SSC， PH 氯化鈉 88g，檸檬酸鈉 44g，去離子水 400ml，充分溶解，室溫下 12ml HCL 調(diào)節(jié) PH 值至 ，用去離子水定容至 500ml,高壓滅菌。使用期間 28℃儲存。保存期不要超過 6 個(gè)月， 若試劑出現(xiàn)混濁或污染應(yīng)丟棄。 2 SSC， PH 177。 20SSC(PH )100ml，去離子水 800ml，充分混勻，室溫下 10M NaOH 調(diào)節(jié)值至 PH 177。 ，用去離子水定容至 1L。使用期間 28℃儲存 。試劑配制 6 個(gè)月后應(yīng)丟棄，若試劑出現(xiàn)混濁或污染應(yīng)丟棄。 變性液： 70%(v/v)甲酰胺 /2 SSC 甲酰胺 35ml， 20SSC(PH )5ml，充分混勻，室溫下調(diào)節(jié)溶液 PH值至 ，用去離子水定容至 50ml。使用期間 28℃儲存。若試劑出現(xiàn)混濁或污染應(yīng)丟棄。試劑配制 7 天后或用于 20 張玻片雜交后應(yīng)丟棄。 乙醇溶液 (70%乙醇、 85%乙醇 ) 將 700ml、 850ml 無水乙醇用去離子水分別稀釋至 1L，使用期間 28℃儲存。試劑配制1 個(gè)月后或用于 20 張玻片雜交后應(yīng)丟棄，若 試劑出現(xiàn)混濁或污染應(yīng)丟棄。 甲酰胺洗滌液： 50%(v/v)甲酰胺 /2 SSC 甲酰胺 75ml11， 20SSC(PH )15ml，充分混勻，室溫下調(diào)節(jié)溶液 PH值至 ，用去離子水定容至 150ml。使用期間 28℃儲存。若試劑出現(xiàn)混濁或污染應(yīng)丟棄。等量分裝至三個(gè)考普林瓶，分別標(biāo)記為“ 1”、“ 2”和“ 3”。試劑配制 7 天后或用于 20 張玻片雜交后應(yīng)丟棄。 %NP40/2 SSC 洗液 PH 177。 20SSC(PH )40ml， NP40 ，去離 子水 300ml 充分混勻，室溫下 10M NaOH 調(diào)節(jié)值至 PH 177。 ，用去離子水定容至 400ml。使用期間 28℃儲存。試劑配制 6 個(gè)月后應(yīng)丟棄，若試劑出現(xiàn)混濁或污染應(yīng)丟棄。 膠原酶 B(’ s BBS) 稱取膠原酶 B(SIGMA， C6885)用 5ml Hank’ s BBS 液溶解， 37℃攪拌溶解 1 小時(shí)， 4℃過夜，濾過消毒， 20℃分裝儲存 . 固定液 (甲醇：冰醋酸體積比 3： 1) 量取 30ml 甲醇和 10ml 冰醋酸，充分混合。使用前新鮮配制 . KCL 低 滲溶液 ( KCL) KCL ，去離子水 300ml，用去離子水定容至 500ml， 28℃儲存。試劑配制 1 個(gè)月后應(yīng)丟棄，若試劑出現(xiàn)混濁或污染應(yīng)丟棄。 100μ g/ml 的 RNase A 配制 RNase A 儲存溶液溶解 (1mg/ml)：溶解 于 1ml2 SSC(PH )中，煮沸 10 分鐘，冷卻至室溫， 20℃分裝儲存。配制 RNase A 工作溶液 (100μ g/ml)取儲存溶液：取 100μ lRNase A 儲存溶液 (1mg/ml)于 900μ l 2 SSC(PH )中，混勻， 20℃分裝儲存。 20mg/ml 的胃蛋白酶儲存溶液 溶解 20mg/ml 胃蛋白酶 (Sigma P7000)于 1ml 無菌水中，煮沸 15 分鐘，冷卻至室溫， 20℃分裝儲存。 1M HCL 濃 HCL ，去離子水 80ml，用去離子水定容至 100ml，室溫儲存。試劑配制 1 個(gè)月后應(yīng)丟棄，若試劑出現(xiàn)混濁或污染應(yīng)丟棄。 HCL 取 1M HCL，加去離子水定容至 40ml。 本實(shí)驗(yàn)所用 CSP3/CSP7 探針包含 2 種 DNA 探針 ，在中期染色體與間期核上均能雜交產(chǎn)生明亮的信號。探針名稱為 7 號染色體著絲粒。 CSP3 探針雜交信號位于人類 3 號染色體，覆蓋整個(gè)著絲粒區(qū)域，熒光信號為綠色 (FITC)，綠色熒光物質(zhì)為細(xì)胞綠，激 發(fā)波長 504nm，發(fā)射波長 532nm。 CSP7 探針雜交信號位于人類 7 號染色體 ，覆蓋整個(gè)著絲粒區(qū)域，熒光信號為橘紅色 (Rhodamine)，橘紅色熒光物質(zhì)為四甲基羅丹明，激發(fā)波長 546nm，發(fā)射波長 576nm。 探針雜交到人類中期細(xì)胞染色體的熒光信號，敏感性達(dá)到 98%以上。 CSP7 DNA 探針雜交到人類 7 號染色體著絲粒 ()的熒光信號，特異性達(dá)到 98%以上。 CSP3 DNA13 探針雜交到人類 3 號染色體著絲粒 ()的熒光信號，特異性達(dá)到 98%以上。探針與非目的染色體無交叉雜交反應(yīng)。 FISH DNA 探針 (20℃避光 ,保存期 1 年 )、雜交緩沖液 (20℃，保存期 1 年 )、 DAPI 復(fù)染劑 (20℃避光，保存期 1 年 )、封片膠 (4℃避光保存 )、無水乙醇 (室溫保存 )、去離子水 (室溫保存 期 7 天 )。其中 FISH DNA 探針、雜交緩沖液及 DAPI 復(fù)染劑均由北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司提供。 3 留取尿液標(biāo)本 留取清晨初次尿液 50ml500ml， 1 小時(shí)內(nèi)送檢。需注意：尿標(biāo)本要新鮮，取后立即送檢(1h 內(nèi) )。放置時(shí)間過久尿中成分可發(fā)生變化，出現(xiàn)細(xì)胞溶解 。容器應(yīng)清潔、干燥，最好為一次性使用，有較大開口便于收集，防止污染 。尿標(biāo)本要防止月經(jīng)血、白帶、精液、前列腺液、糞便、煙灰等異物混入 。有明顯標(biāo)記。如病人姓名、住院號、收集日期等并須粘貼在容器上 。單次收集的細(xì)胞數(shù)目達(dá)不到要求，可以將尿液處理到固定液，多次收集 尿液標(biāo)本后，混合在一起滴片來滿足細(xì)胞數(shù)目的要求。 4 FISH 操作前為尿液或膀胱沖洗液中的細(xì)胞進(jìn)行樣本玻片制備及預(yù)處理過程 收集晨尿 50500ml，用 50 ml 離心管離心 (12001400RPM 離心 1015 分鐘 )，去清，加樣，再離心直到沉淀物足夠滴片。 去上清，用 ml 膠原酶 B 重新吹打懸
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