【文章內(nèi)容簡介】 負(fù)超螺旋 松弛 DNA 正超螺旋 空間結(jié)構(gòu)改變 10bp/螺旋 空間結(jié)構(gòu)改變 拓?fù)洚悩?gòu)酶 or溴化乙錠 拓?fù)洚悩?gòu)酶 or溴化乙錠 軸心在中心 DNA扭曲與 雙螺旋相同 DNA扭曲與 雙螺旋相反 DNA雙螺旋額外多或少轉(zhuǎn)幾圈，空間機構(gòu)改變，產(chǎn)生額外張力得不到釋放，導(dǎo)致原子空間重排，造成扭曲 ——超螺旋。 在電場的作用下，相同分子量的超螺旋環(huán)狀 DNA比線性DNA遷移率大，線性 DNA遷移率大于開鏈 DNA。 瓊脂糖電泳 閉環(huán) DNA 自然條件下， DNA常以閉環(huán)形式存在，即兩條單鏈均為環(huán)狀且相互連在纏繞的數(shù)目為雙螺旋的螺旋數(shù)，稱為連接數(shù)（ Linking number， Lk）。 超螺旋 超螺旋是 DNA軸線的再次螺旋，若以 Lk176。 表示松弛閉環(huán) DNA的連接數(shù)， Lk 176。 的改變將導(dǎo)致超螺旋。大部分天然 DNA呈負(fù)的超螺旋，即 DNA變形的方向與雙螺旋解旋的方向相反。 拓?fù)洚悩?gòu)體 具有特定連接數(shù)的環(huán)狀 dsDNA分子稱為拓?fù)洚悩?gòu)體（ topoisomer），除非其中的一條鏈或兩條鏈均遭到破壞，其連接數(shù)不會發(fā)生改變。拓?fù)洚悩?gòu)體的差異是連接數(shù)的不同。 纏繞和扭曲 超螺旋在幾何上分為纏繞（ twist）和扭曲（ writhe），前者指雙螺旋是緊繞或松繞的，后者沿雙螺旋軸本身的纏繞變化。根據(jù)等式 :Lk =Tw＋ Wr，纏繞和扭曲是可以相互轉(zhuǎn)化的。超螺旋的水平可用連接數(shù)的變化 Lk來衡量。 某 BDNA 1350bp，每螺旋 10bp，在松弛情況下 L = T = 1350/10 = 135, W= 0，無超螺旋 若 DNA 一端固定，另一端解螺旋 5圈，在兩端封閉： L = 135－ 5 = 130 由于分子內(nèi)張力，出現(xiàn)兩中可能情況： ※ 在分子內(nèi)保持一個單鏈區(qū)， T = 130， W = 0 ※ DNA張力趨于保持 BDNA原狀， T = 135， L = 130， W = － 5 DNA分子超盤繞 5次的負(fù)超螺旋。 Lk =Tw＋ Wr 的計算 DNA Unwinding Causes Topological Problems (Transcription) Unwound Parental Duplex Over Wound region 20 嵌入劑 嵌入劑（ intercalator），如澳化乙錠（ ethidium bromide， EB），通過嵌入到配對堿基之間的方式與 DNA結(jié)合，導(dǎo)致 DNA雙螺旋的局部解旋（ untwisting）；如果是閉環(huán) DNA，則會使纏繞增加。 超螺旋能 負(fù)超螺旋的 DNA具有很強的扭力，這一能量促使 DNA雙螺旋的解旋，并驅(qū)動需解旋的 DNA的解旋過程。 (topoisomerase) 催化ＤＮＡ拓?fù)渥儤?gòu)體（ topoisomer)相互轉(zhuǎn)化的酶。能改變 DNA的連接數(shù)。 通過暫時破壞 DNA骨架的單鏈或雙鏈，拓?fù)洚悩?gòu)酶（ topoisomerases）改變DNA超螺旋的水平。第 I類酶使 Lk改變 177。 1；第 II類酶使 Lk改變 177。 2。 DNA促旋酶（ gyrase）利用 ATP水解提供的能量為 DNA引進(jìn)負(fù)超螺旋 。而拓?fù)洚悩?gòu)酶 IV使子染色體解離。 Model for Topo II Mechanism 第三章 DNA的復(fù)制與損傷修復(fù) Replication and Repair of DNA 本章主要內(nèi)容 一、 DNA的半保留復(fù)制 二、 DNA復(fù)制的起點與方向 三、 DNA的半不連續(xù)復(fù)制 四、與 DNA 復(fù)制有關(guān)的蛋白質(zhì) 五、大腸桿菌 DNA的復(fù)制過程 六、復(fù)制起始的時序控制 七、真核生物 DNA復(fù)制特點 八、 DNA損傷的修復(fù) 目的要求 1. 掌握遺傳信息傳遞的中心法則 。 2. 掌握 DNA復(fù)制的一般規(guī)律： DNA的半保留復(fù)制 、 DNA的半不連續(xù)復(fù)制的概念 。 3. 了解三種大腸桿菌 DNA聚合酶的催化特性及其功 用；了解原核生物 DNA的復(fù)制過程 。 4. 了解使 DNA損傷的因素； DNA損傷的修復(fù)機制： 錯配修復(fù) 、 堿基切除修復(fù) 、 核苷酸切除修復(fù) 、 直接修 復(fù) 、 重組修復(fù)及傾向差錯的修復(fù)的過程及過程所需要 的酶類；了解 DNA損傷修復(fù)的意義 。 目的要求 19641970 發(fā)現(xiàn)勞氏肉瘤病毒的遺傳信息傳遞方式：逆轉(zhuǎn)錄 1953年， Watson和 Crick提出中心法則：遺傳信息的單向流動。 中心法則： 病毒（復(fù)制） 復(fù)制 轉(zhuǎn)錄 DNA RNA 蛋白質(zhì) 翻譯 逆轉(zhuǎn)錄 RNA的復(fù)制存在于 RNA病毒 DNA是生物遺傳的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，生物機體的遺傳信息以密碼的形式編碼在 DNA分子上，表現(xiàn)為特定的核苷酸排列順序，并通過 DNA的復(fù)制由親代傳遞給子代。在后代的生長發(fā)育過程中，遺傳信息自 DNA轉(zhuǎn)錄給 RNA,然后翻譯成特異的蛋白質(zhì)，以執(zhí)行各種生命功能，使后代表現(xiàn)出與親代相似的遺傳性狀。 ? 復(fù)制： 以親代 DNA或 RNA為模板，根據(jù) 堿基配對的原則 ，在一系列酶的作用下，生成與親代相同的子代 DNA或 RNA的過程。 幾個基本概念： ? 逆轉(zhuǎn)錄： 以 RNA為模板，在 逆轉(zhuǎn)錄酶 的作用下，生成 DNA的過程。 ? 翻譯： 亦叫轉(zhuǎn)譯，以 mRNA為模板，將 mRNA的密碼解讀成蛋白質(zhì)的 氨基酸順序 的過程。 ? 轉(zhuǎn)錄： 以 DNA為模板，按照堿基配對原則合成RNA，即將 DNA所含的遺傳信息傳給 RNA，形成一條 與 DNA鏈互補的 RNA的過程。 Reverse transcription 中心法則圖示 一、 DNA的半保留復(fù)制 : ： 1958年 Meselson和 Stahl用同位素 15N標(biāo)記 大腸桿菌 DNA,首先證明了 DNA的半保留復(fù)制。 以 親代 DNA雙鏈 為模板以 堿基互補 方式合成子代 DNA，這樣新形成的子代 DNA中，一條鏈來自親代 DNA，而另一條鏈則是新合成的，這種復(fù)制方式叫 半保留復(fù)制 。 DNA復(fù)制的可能方式 全保留與全新復(fù)制 分散復(fù)制 半保留復(fù)制 DNA半保留復(fù)制圖示： 半保留復(fù)制的證明： ? Meselson 和 Stahl將同位素 15N標(biāo)記的15NH4Cl加入大腸桿菌的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 12代，使大腸桿菌的 DNA都帶上 15N的標(biāo)記，然后將該大腸桿菌轉(zhuǎn)入 14N的普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，分離子一代、子二代、子三代、子四代 DNA，進(jìn)行 氯化銫 密度梯度離心，實驗證明了 DNA的半保留復(fù)制。 15NDNA的密度大于 14NDNA的密度 親代 DNA（ 15N～ 15N） 子一代 DNA（ 15N～ 14N） 子二代 DNA (15N～ 14N， 14N～ 14N 1:1) 子三代 DNA (15N～ 14N， 14N～ 14N 1:3) 子四代 DNA (15N～ 14N， 14N～ 14N 1:7 ) 親代 DNA與子二代 DNA的混合物 親代 DNA與子四代 DNA的混合物 復(fù)制中的大腸桿菌染色體放射自顯影圖 DNA的半保留復(fù)制的生物學(xué)意義： ? DNA在代謝上的穩(wěn)定性并非指 DNA是一種惰性物質(zhì)。 ? DNA的半保留復(fù)制表明 DNA在代謝上的 穩(wěn)定性 ，是 保證親代的遺傳信息穩(wěn)定地傳遞給后代必要措施。 雙向復(fù)制 單向復(fù)制 二、 DNA復(fù)制的起點與方向 復(fù)制中的 DNA 復(fù)制原點 復(fù)制叉 DNA復(fù)制的主要方式 ? 大腸桿菌雙鏈 環(huán)狀 DNA的復(fù)制（ 一個 復(fù)制起點，雙向復(fù)制） 3? ? 不同位置 D環(huán)式 復(fù)制方式（線粒體雙鏈環(huán)狀 DNA：兩條鏈的 復(fù)制起點 不同位置，且復(fù)制不同步） ? 真核細(xì)胞 線狀染色體 DNA的復(fù)制方式（ 多個 復(fù)制起點，雙向復(fù)制） ? 單向 滾環(huán)式 復(fù)制（噬菌體 ?X174DNA— 單鏈環(huán)狀） 三、 DNA復(fù)制的半不連續(xù)性 前導(dǎo)鏈 滯后鏈 岡崎片段 前導(dǎo)鏈： 以 3’ → 5