【文章內(nèi)容簡介】 和適用范圍廣的新方法來測定 BOD， 因此生物傳感器監(jiān)測 BOD 的技術(shù)和方法應(yīng)運而生 ， 與傳統(tǒng)的標準稀釋測定法通過絕對耗氧量計算 BOD 不同 ， 生物傳瓊州學(xué)院本科 生 畢業(yè)論文 2 感器測定 BOD 只涉及到初始氧化速率 ， 兩者之間的相關(guān)性可以通過對標準溶液的測 定獲得， 這就可以將測定時 間 縮短到 lh 以內(nèi) 。 1977 年 ， Kurabe 等研制了第一 臺 BOD 微生物傳感器 [8], 它由固定化活性污泥與氧電極構(gòu)成 , 僅幾十分鐘就可完成 BOD 測量 , 大大減少了 BOD 的分析時間 , 降低了分析成本 , 實現(xiàn)了 BOD快速測 定 。 Kurabe 最初研制的傳感器壽命僅有 10 天 ， 后改用多孔醋酸纖維膜固定酵母細胞制成 的微生物傳感器， 可連續(xù)使用 17 天 。 Strand 等 (1984)[9]研制 BOD 傳感器 ,用于城市污水測定 ,成功工作了 20 多天，后來在微生物、 換能器 、 測量原理方面有了許多改進 ， 出現(xiàn)了各種各樣的 BOD 傳感器 , 我們國家在 20 世紀 80年代起也有一批學(xué)者進行著不斷地研究和探索 。 如河北科技大學(xué)的孫裕生 [3]。 復(fù)旦大學(xué)的鄧家棋 [4]。 天津環(huán)境監(jiān)測中心的魏恩棋 [5]等人均發(fā)表過 BOD 微生物傳感器的研究論文 。 日本在世界上率先研制成以微生物電極 為傳感器的工業(yè)快速BOD 測定儀 ,并于 1990 年頒布了微生物電極法工業(yè)標準 （ JISK36021990） [6]。我國也于 2020 年頒布了該方法的行業(yè)標準 （ HJ/T86） [7], 為該類儀器的市場準入制定了工作標準 。 隨著研究的不斷深入 ， 不同的 BOD 快速檢測儀問世 ， 在一定程度上彌補了傳統(tǒng)方法測定水中 BOD 的不足 ， 并逐漸出現(xiàn)了可用于測定廢水中BOD 值的生物傳感器和適于現(xiàn)場測定的便攜式測定儀 。 隨著 BOD 決速測定研究的不斷深入 ， 還有研究發(fā)現(xiàn) BODst(快速 BOD 測定值 )還可作為在線監(jiān)測生物處理過程的一個重要參數(shù) ， 因此 ， 生物傳感器監(jiān)測 BOD 對于水質(zhì)的實時在線監(jiān)測以及提高水質(zhì)污染的監(jiān)測水平和廢水處理過程的控制水平 ， 均有十分重要的意義 。 對 BOD 決速測定儀的研究也成為水質(zhì)檢測科技發(fā)展的方向 。 至今 ， 普通廢水 BOD 傳感器已經(jīng)相對成熟 ， 并己市場化 ， 但選擇不同的微生物膜 ， 適宜的儀器及適宜的分析條件 ， 一直是環(huán)境監(jiān)測者競相探討的重點問題 [16]。 課題研究的目的和意義 生物傳感器縮短了水體 BOD 測定周期，節(jié)省了人力、物力、財力，具有高選擇性，高靈敏度，較好的穩(wěn)定性，低成本特點。更重要的是能及時為管理和決策部門為掌握地表水，工業(yè)廢水和 生活污水排放現(xiàn)狀（尤其是污染事故的發(fā)生）提供科學(xué)決策的依據(jù)，同時也為工業(yè)企業(yè)污水治理，污水處理廠的污水治理工藝設(shè)計、控制、處理效率及時提供參數(shù)?？梢灶A(yù)見，該儀器的完善。成功研制將帶瓊州學(xué)院本科 生 畢業(yè)論文 3 來較大的環(huán)境效益和社會效益 ,將會成為最具潛力的環(huán)境監(jiān)測工具 。 而微生物膜是 微生物傳感器 的核心部分 ， 所選用的菌株種類 、 數(shù)量及其固定化方法決定了 微生物傳感器 的響應(yīng)特性和使用壽命 ， 因此高效微生物膜的制備是研究的重點[]。 本課題組主要對目前 微生物傳感器 中微生物膜制備這一核心技術(shù)進行研究 ，旨在確定微生物膜制作的適宜菌種 。 固定化方法 及材料 ， 確定切實可行的微生物膜制備 工藝 ， 以得到性能穩(wěn)定 、 活化周期短 、 對待測溶液濃度變化適應(yīng)性強 。 使用壽命長的微生物膜 ， 滿足 微生物傳感器 的使用 。 課題 研究 的 內(nèi)容 本研究首次從三亞近海養(yǎng)殖水體污染嚴重的水域分離純化到三株耐鹽、耐高壓的海洋酵母菌，通過相關(guān)理化實驗、發(fā)酵譜和碳源同化譜 The Yeast, A Taxonomic study (Kurtzman amp。 Fell, 2020)書中的標準菌株進行比對，初步確認獲得的三株海洋酵母菌為 Debaryomyces hansenii HXY09, Pichiaguiller mondii HXY04 和 Candida parapsilosis HXY06[4]。進一步采用夾膜法將上述三株目標菌株玻璃纖維濾紙直接固定化制備成微生物膜，安裝于 Clark 溶氧電極初步構(gòu)建近海養(yǎng)殖水體 BOD 微生物傳感系統(tǒng)，分析了各種因素對傳感系統(tǒng)的響應(yīng)特性的影響，優(yōu)化了傳感器的監(jiān)測條件，為實現(xiàn)近海水體 BOD 測定的數(shù)據(jù)處理自動化控制奠定基礎(chǔ)。 瓊州學(xué)院本科生畢業(yè)論文 4 第二章 實驗材料和方法 材料 菌種與來源 酵母菌 Debaryomyces hansenii HXY09， Pichia guilliermondii HXY04 和Candida parapsilosis HXY06 三株菌分別以高分子有機污染物 為 唯一碳源，從海南省三亞海寶近海養(yǎng)殖專業(yè)合作社養(yǎng)殖場 （ 拐點坐標（ N=18176。14′″，E=109176。21′″）水面下約 m） 中 多輪 分離篩選 獲得 （具體篩選和鑒定實驗另見文章報道） 。 培養(yǎng)基 酵母菌培養(yǎng)基：葡萄糖 10g/L、胰蛋白胨 5 g/L、酵母膏 g/L、 (NH4)2HPO4 10g/L、 KH2PO4 20 g/L、 、 g/L，海水配制， 8磅 15 min滅菌。 試劑和儀器 聚乙烯醇 (PVA1799 177。50)、氧氣 (%) 由三亞市人民醫(yī)院提供，其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純； GC9800 型氣相色譜儀購自上?？苿?chuàng)色譜有限公司，Pasco CI6542溶解氧傳感器和 Science Workshop 500 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（ Pasco Scientific, Roseville, CA）， Potentiostat/Galvanostat 283 A型電化學(xué)測試系統(tǒng)， M 270數(shù)據(jù)處理軟件， TGL16G型臺式離心機購自上海安亭科學(xué)儀器廠 [14]。 海洋酵母活菌總數(shù)與生長周期 [10] 無菌操作取事先已滅菌的 15 cm玻璃試管 8支，依次編號 1~8號，分別加入 9 mL滅菌空白培養(yǎng)基，用 1mL的無菌微量移液器吸取 Debaryomyces hansenii HXY09菌懸液，沿試管壁緩慢注于盛有 9mL空白培養(yǎng)基的 1號管中（注意吸頭尖瓊州學(xué)院本科生畢業(yè)論文 5 端不要觸及稀釋液面），用渦旋式振蕩器（德國， Heidolph）充分混合均 勻，制成 10倍稀釋的發(fā)酵液， 按照上一步驟的操作方法，依次制備 10倍系列稀釋的 28號管，每遞增稀釋 1 次換用 1支無菌吸頭 ； 從 58號管中各取 mL 稀釋液入固體培養(yǎng)基中，用經(jīng)火焰滅菌的玻璃棒涂抹均勻，每個稀釋度做 2個平皿。同時分別吸取 mL 空白培養(yǎng)基入 2個 無菌 平皿 內(nèi)作空白對照。 選取菌落數(shù)在 30300 CFU（ ColonyForming Units，菌落計數(shù)單位 ）之間、無蔓延菌落生長的平板計算菌落總數(shù)。低于 30 CFU的平板 可 記錄具體菌落數(shù)，大于 300 CFU的平板記錄為多不可計。每個稀釋 度的菌落數(shù) 可以 取 2個平板的平均數(shù) ， 若只有一個稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)，計算 2個平板菌落數(shù)的平均值，用平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)后再乘以 5，作為每毫升發(fā)酵液中活菌總數(shù)結(jié)果。若有 2個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)時， 則按下式計算，N=∑C/(n1+) 5d。式中： N為活菌總數(shù)， ∑C為平板（含適宜范圍菌落數(shù)）菌落數(shù)之和， n1為第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個數(shù)， n2為第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個數(shù)， d為稀釋倍數(shù)（第一稀釋度）。并以菌株的培養(yǎng)時間為橫坐標，以菌株的生長速率為縱坐標作圖，既得 該菌株的生長曲線。 BOD 標準溶液的配制 實驗采用的標準溶液為 GGA溶液 [8]， 即： 150 mg/L谷氨酸和 150 mg/L葡萄糖，15 mg/L KH2PO4 ， 30 mg/L (NH4)2SO4 ， 50 mg/L MgSO4 .7H2O， mg/LCaCl2， mg/L ， mg/L ， 105 mg/L NaHCO3， 10 mL/L 微量元素。微量元素成分為 ： g/L 氨三乙酸 , g/L FeSO4 .7H2O, g/L，, g/L CoCl2 .6H2O, g/L CaCl2 .2H2O, g/L ZnCl2 , g/L CuCl2 .2H2O, g/L H3BO3 , g/L