【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 2 米左右，如此龐大的 DNA 鏈要全部?jī)?chǔ)存在直徑約 10 微米的細(xì)胞核中。此外，基因及其調(diào)控元件需要交流，染色質(zhì)必須打開(kāi)，允許轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。因此，人們常常提出這樣的疑問(wèn)：“基因的線(xiàn)性順序與空間排布如何關(guān)聯(lián) ?”“基因如何被遙遠(yuǎn)的元件所調(diào)控 ?”。 闡明染色質(zhì)復(fù)雜結(jié)構(gòu)的技術(shù)有染色質(zhì)構(gòu)象捕獲及更高通量的衍生技術(shù) 4C、5C，這些提供了長(zhǎng)距離的染色質(zhì)相互作用，但不能擴(kuò)展到 整個(gè)染色質(zhì)相互反應(yīng)組。在 2021 年末，兩種新方法的迸發(fā)，有望繪出全基因組范圍的相互作用圖譜。 馬薩諸塞大學(xué)的 Job Dekker 和 Broad 研究院的 Eric Lander 開(kāi)發(fā)出了 HiC 技術(shù)，能捕獲全基因組范圍的相互作用 1。 HiC 是一種 3C 衍生技術(shù)，基于交聯(lián)DNA 與生物素 linker 的鄰近連接，能夠拉下 (pull down)片段，接著進(jìn)行高通量測(cè)序。從 800 萬(wàn)個(gè)讀取對(duì)中，研究人員產(chǎn)生了基因組范圍的接觸模型，分辨率在 1 MB。 Dekker 認(rèn)為 HiC 的難度不在染色質(zhì)捕獲本身，而在于數(shù)據(jù)的闡釋。 “數(shù)據(jù)中存在明顯的聚合物特征，它們確定了背景。”他推測(cè)，如果想以 1 KB 的分辨率查看染色體的三維結(jié)構(gòu)，還需要數(shù)億個(gè)讀取。 研究人員還發(fā)現(xiàn)了出人意料的結(jié)果：染色質(zhì)并非類(lèi)似于緊湊、多節(jié)的結(jié)構(gòu)，而是一種無(wú)節(jié)的緊密壓縮構(gòu)象，有活性和無(wú)活性的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域折疊成兩個(gè)空間各異的區(qū)室。 一個(gè)月后，新加坡基因組研究院的 Yijun Ruan 和 Edwin Cheung 在《 nature》上發(fā)表了另一項(xiàng)重要技術(shù) CHIAPET 2。它是對(duì)讀雙標(biāo)簽 (PET)測(cè)序與染色質(zhì)免疫沉淀 (ChIP)的結(jié)合，在堿基對(duì)的分辨率解析了蛋白介導(dǎo) 的功能相互作用。 研究人員用 II型限制性?xún)?nèi)切酶將免疫沉淀的 DNA片段與條形碼 linker 連接，產(chǎn)生了 PET，然后對(duì)染色質(zhì)相互作用 (ChIA)的 PET 進(jìn)行高通量測(cè)序，生成了轉(zhuǎn)錄因子依賴(lài)的相互作用圖譜。 本科 課程 設(shè)計(jì)論文 11 對(duì)于 Ruan 而言，數(shù)據(jù)闡釋中的最大問(wèn)題在于如何處理噪音?！霸胍魜?lái)自?xún)蓚€(gè)水平，生物和技術(shù)?！鄙镌胍羰怯扇旧|(zhì)的動(dòng)態(tài)性質(zhì)引起的，因?yàn)樗恢痹谝苿?dòng)，在任一指定時(shí)間點(diǎn)許多相互作用都是無(wú)意義的。 Ruan 的理論是有意義的相互作用更強(qiáng)，因此能承受更劇烈的片段化方法。技術(shù)上的噪音則來(lái)自鄰近連接步驟。為了控制這種嵌合體 的形成，研究小組將染色質(zhì)材料均分成兩等份，隨后加入帶有不同條形碼的 linker，在連接之前再次混勻。嵌合體將在同一個(gè) PET 上帶有不同的 linker，隨后被排除。 HiC 和 ChIAPET 從兩個(gè)不同的方向靠近染色質(zhì)相互作用組，一個(gè)提供了染色質(zhì)如何在核中折疊的鳥(niǎo)瞰，另一個(gè)觀察了特定蛋白對(duì)基因組結(jié)構(gòu)的影響。為了增加它們的影響力，提供更為精細(xì)的染色質(zhì)相互作用組圖譜，兩種方法都將向中心靠攏。更高的測(cè)序能力以及新的分析方法將增加 HiC的分辨率，最終達(dá)到 1 KB的分辨率。 ChIAPET 在更多蛋白如聚合酶上的應(yīng)用 ，將鑒定出參與轉(zhuǎn)錄等過(guò)程的所有染色質(zhì)相互作用。 疊加 HiC 圖譜和 ChIAPET 圖譜，以及現(xiàn)有的注釋?zhuān)瑢⒂兄诹私馊S空間的基因調(diào)控。 下面重點(diǎn)講解 ChIAPET 技術(shù)。 ChIAPET 技術(shù) 染色質(zhì)相互作用在基因組功能中的重要性一直備受關(guān)注。目前，研究染色質(zhì)相互作用的技術(shù)主要有兩大類(lèi)：分子探針技術(shù)和分子相互作用圖譜技術(shù)。分子探針技術(shù)包括電子顯微鏡技術(shù)、原子力顯微鏡技術(shù)和熒光原位雜交技術(shù)等，它們能夠提供直觀的圖像，為染色質(zhì)相互作用的研究提供依據(jù)，但其圖像的分辨率低，而且不能同時(shí)研究多個(gè)位點(diǎn)。 分子相互作用圖譜技術(shù)包括染色質(zhì)構(gòu)象捕獲技術(shù)和基于 3C技術(shù)的 ChIP3C、 4C、 5C技術(shù)等，利用這些技術(shù)能夠捕獲染色質(zhì)點(diǎn)與點(diǎn)之間或多點(diǎn)之間的相互作用，但它們無(wú)法在全基因組范圍內(nèi)研究染色質(zhì)的相互作用。總之，染色質(zhì)相互作用的研究一直處于分辨率低和范圍局限的狀態(tài)。 Fullwood等 2021年 11月在《 Nature》上發(fā)表文章中提出了一項(xiàng)能夠分析全基因組染色質(zhì)相互作用的新技術(shù) —— 配對(duì)末端標(biāo)簽測(cè)序分析染色質(zhì)相互作用(chromatin interaction analysis by pairedend tagsequencing, ChIAPET)技術(shù)。 本科 課程 設(shè)計(jì)論文 12 ChIAPET技術(shù)是利用 PET測(cè)序技術(shù)研究免疫沉淀后鄰近式連接的 DNA片段，以得到染色質(zhì)相互作用的技術(shù)。它靈敏，準(zhǔn)確，對(duì)在全基因組范圍內(nèi)研究染色質(zhì)相互作用具有重大意義，現(xiàn)簡(jiǎn)介如下。 . ChIAPET技術(shù)的原理與方法 ChIAPET技術(shù)應(yīng)用了 PET測(cè)序技術(shù)的基本原理。 PET測(cè)序技術(shù)的獨(dú)特之處在于構(gòu)建配對(duì)末端測(cè)序模板。從目的 DNA片段兩個(gè)末端提取短標(biāo)簽并將它們配對(duì)構(gòu)成一個(gè) PET，對(duì) PET進(jìn)行高通量測(cè)序，利用標(biāo)簽序列定位目的 DNA片段在基因組中的位 置。為了獲得短標(biāo)簽，將目的 DNA片段兩個(gè)末端分別與設(shè)計(jì)好的半連接子 (linker)相連。半連接子為具有 MmeI限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的寡聚核苷酸序列，而 MmeI限制性?xún)?nèi)切酶能夠水解其識(shí)別位點(diǎn)下游 18/20個(gè)堿基對(duì)。連接子連接后將 DNA片段兩個(gè)末端配對(duì)，隨后加入 MmeI限制性?xún)?nèi)切酶，便可得到“標(biāo)簽 連接子 標(biāo)簽 (taglinkertag)”結(jié)構(gòu)，即 PET(圖 1)。 本科 課程 設(shè)計(jì)論文 13 ChIAPET技術(shù)中，借助 ChIP技術(shù)甲醛固定細(xì)胞、超聲斷裂染色質(zhì) [圖 2(A)]、免疫沉淀 [圖 2(B)]，以獲得與目的蛋白質(zhì)因子結(jié)合的染色 質(zhì)片段。該染色質(zhì)片段又被稱(chēng)為 ChIP DNA片段，即 PET測(cè)序技術(shù)中所需的目的 DNA片段。然后進(jìn)行連接子連接 [圖 2(C)]。為了在確定蛋白質(zhì)因子結(jié)合位點(diǎn)的同時(shí)捕獲結(jié)合位點(diǎn)間的相互作用，將同一蛋白質(zhì)因子結(jié)合的 DNA片段末端先配對(duì) [圖 2(D)]再進(jìn)行逆轉(zhuǎn)交聯(lián)[圖 2(E)]。隨后進(jìn)行 MmeI限制性?xún)?nèi)切酶水解 [圖 2(F)]和高通量測(cè)序。這樣將產(chǎn)生兩種類(lèi)型的 PET：自連接 PET(selfligation PET)和間連接 PET(interligationPET)。 PET 如果一個(gè) PET的兩 個(gè)標(biāo)簽來(lái)自同一條染色質(zhì)，基因組跨度在 ChIP DNA片段范圍 (小于 3 kb)內(nèi)，方向相同且為相應(yīng)單鏈連接，便被認(rèn)為是一個(gè) ChIPDNA片段中兩個(gè)標(biāo)簽的自連接，稱(chēng)為自連接 PET。自連接 PET是確定蛋白質(zhì)因子結(jié)合位點(diǎn)的基礎(chǔ)。通過(guò)構(gòu)成自連接 PET的兩個(gè)標(biāo)簽可以確定其代表的 ChIPDNA片段，而該 ChIP DNA片段包含蛋白質(zhì)因子結(jié)合位點(diǎn)。利用峰檢出程序 (peakfinding algorithm)，把所有自連接 PET兩個(gè)標(biāo)簽代表的 ChIP DNA片段映射 (map)到參照基因組上，再將參照基因組每一區(qū)域被映射的次 數(shù)轉(zhuǎn)化為不同高度的峰，每一區(qū)域被映射的次數(shù)越多，峰越高。其每一高峰，都是大量的包含蛋白質(zhì)因子結(jié)合位點(diǎn)的 ChIP DNA片段重疊的區(qū)域，被認(rèn)為是蛋白質(zhì)因子結(jié)合位點(diǎn)。除高峰外，其它峰為弱的蛋白質(zhì)因子結(jié)合位點(diǎn)或?qū)嶒?yàn)噪音 (experimental noise)。 PET 如果一個(gè) PET不符合自連接 PET的標(biāo)準(zhǔn)，其便為兩個(gè) ChIP DNA片段間的連接，被稱(chēng)作間連接 PET。間連接 PET又分為三類(lèi)：染色質(zhì)內(nèi)的間連接PET(intrachromosomal interligation PET)、染色質(zhì)間的間連 接PET(interchromosomal interligation PET)和不同方向的間連接 PET(different 本科 課程 設(shè)計(jì)論文 14 orientation interligation PET)。 其中，染