【文章內(nèi)容簡介】 的近球形，褐色，光滑，頂生或間生，單生或串生的厚垣孢子，厚垣孢子也可聚集成團(tuán)。對于該病原菌有性階段的分類地位目前尚不明確，曾有報(bào)道為屬于球腔菌屬 Mycosphaerella、隔孢球殼屬 Didymosphaeria或亞隔孢殼屬 Didymella。曾經(jīng)有報(bào)道稱，有性階段的子囊殼呈深褐色，球狀，有短嘴或無嘴，單生，直徑為 65~154181。m，埋生于寄主表皮下。子囊呈柱狀或棍棒狀，多數(shù)子囊有 10 1 個分化的足胞，大小為 10~1735~60181。m。子囊孢子為橢圓形，大小為5~7~16181。m，有 1個隔膜，光滑，透明至淡黃色，隨著成熟而變暗。但該階段在病害侵染中不起作用 [1]。 參考文獻(xiàn)： [1] 徐秀娟主編 . 中國花生病蟲草鼠害 [M]. 北京 : 中國農(nóng)業(yè)出版社 , 2020, 49. [2] 范文忠 , 程麗 , 李云江 . 不同碳源氮源對花生網(wǎng)斑病生長的影響 [J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) , 2020, 39(26): 1602016021. [3] 孫曉會 . 花生主要病蟲害及防治措施 [J]. 中國果菜 , 2020, (9): 1821. [4] 吳獻(xiàn)忠 , 張衛(wèi) , 李榮花 , 等 . 花生網(wǎng)斑病研究進(jìn)展 [J]. 萊陽農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào) , 2020, 17(4): 294297. [5] 傅俊范 , 楊鳳艷 , 周如軍 , 等 . 遼寧花生病蟲發(fā)生危害及種類鑒定 [J], 植物保護(hù) , 2020,39（ 1） : 144147. [6] 何健三 . 關(guān)于花生網(wǎng)紋污斑病的研究與討論 [J]. 花生科技 , 1988（ 4） :1216. [7] 全鑫 , 宋玉立 , 何文蘭 . 花生網(wǎng)斑病國內(nèi)外研究進(jìn)展 [J]. 河南農(nóng)業(yè)科 , 2020(7):1316. [8] 王振躍 , 王守正 . 河南省花生網(wǎng)斑病的初步研究 [J]. 河南農(nóng)業(yè)科技 , 1993,2(7):23 — 25. [9] 曹玉良 . 花生品種間關(guān)聯(lián)性的研究 [J]. 花生科技 , 1998,1(4):l4. [10] 李君彥 , 李有志 , 焦鋒 , 王翠蕓 . 陜西省花生網(wǎng)斑病病原菌的 研究 [J]. 花生科技 , 1991, (1): 1~6. 三、研究方案 (研究內(nèi)容、目標(biāo)、研究方法、技術(shù)路線、擬解決的問題、特色或創(chuàng)新點(diǎn)等 ) 材料 材料 花生（品種為白沙 1016），玉米粉，瓊脂， 燕麥片，蔗糖 ，馬鈴薯，葡萄糖等。 儀器 光照培養(yǎng)箱，立式壓力蒸汽滅菌鍋， Olympus 光學(xué)顯微鏡， LETCA ICC50 HD 11 攝像顯微鏡等。 花生網(wǎng)斑病病原菌的分離、純化 對 2020 年田間發(fā)病的花生網(wǎng)斑病病葉進(jìn)行分離、純化。分離純化培養(yǎng)基 為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（ PDA），制作 步驟如下： （ 1) 根據(jù)培養(yǎng)基配方，計(jì)算好各種成分的量及要求配置的總量，分別秤取或量取 馬鈴薯 200g，瓊脂 ，葡萄糖 ，加 自來水至 1000mL。 （ 2） 將馬鈴薯切成 1cm 邊長的塊狀加入自來水中，文火煮沸后計(jì)時 30min （ 3） 趁熱用四層紗布過濾，將濾液用蒸餾水定容至 1000mL。 （ 4） 再把培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至鍋內(nèi)，加入瓊脂 粉 ，在加熱的過程中不斷攪拌，待充分溶解后加入 葡萄糖， 并攪拌均勻。 （ 5） 分裝，將配置好的培養(yǎng)基裝入三角瓶，封口。 （ 6） 高壓蒸汽滅菌。 121℃ 滅菌 20min。 病原菌的分離、純化 （ 1） 分離試驗(yàn)開始前，將 PDA 培養(yǎng)基在微波爐中加熱融化。 （ 2） 分離純化實(shí)驗(yàn)要在超凈工作臺進(jìn)行無菌操作，將所需物品按次放在工作臺上，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前要提前打開紫外燈照射消毒 15min。 （ 3） 保證自身潔凈，用肥皂洗凈雙手，再用 70%酒精擦手及所需工具。 （ 4） 在超凈工作臺上將冷卻好的培養(yǎng)基倒入滅過菌的培養(yǎng)皿，形成 2~3mm 厚的平板，靜置冷卻使其凝固。要在酒精燈火焰旁邊操作，避免造成污染。 （ 5） 實(shí)驗(yàn)材料選擇發(fā)病花生葉片上單個的網(wǎng)斑病斑，以減少雜菌污染。用刀片在花生葉的病健交界處切取約 5mm 大小的組織塊。將組織塊在酒精中浸泡 20s，取出后在 %升汞溶液里浸泡 2~3min 進(jìn)行表面消毒，操作注意安全并且注意回收升汞。再將組織塊在無菌水中沖洗 3 次，將組織塊用鑷子搗碎，接種時盡量使用小的組織塊。用無菌操作法將病組織接種到培養(yǎng)皿上，每皿接種 2~3 塊，均勻分布在皿中。蓋上皿蓋，用保鮮膜封口，倒置在 25℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng) 3~4 天左右，觀察待分離菌生長情況。 分離、純化后得到兩種純培養(yǎng)物，經(jīng)對二者進(jìn)行致病性測定，發(fā)現(xiàn)均可使離體花生葉片致病，且致病后癥狀相同，將其分別編號為 A、 B。 12 不同培 養(yǎng)條件對花生網(wǎng)斑病菌產(chǎn)孢的影響 培養(yǎng)基的制備 選用 3 種產(chǎn)孢培養(yǎng)基，分別為 玉米培養(yǎng)基 、燕麥培養(yǎng)基和花生葉汁培養(yǎng)基（自制）。 （ 1） 玉米培養(yǎng)基的 制備 1）根據(jù)培養(yǎng)基配方，計(jì)算好各種成分的量及要求配置的總量，分別秤取或量取玉米粉 ，瓊脂粉 ，加自來水至 1000mL。 2）在鍋內(nèi)加入一定量的自來水煮沸，再加入 100g 玉米粉，攪拌均勻， 文火煮沸后計(jì)時 1h。 3）趁熱用四層紗布過濾，將濾液用自來水定容至 1000 mL。 4）再把濾液轉(zhuǎn)移至鍋內(nèi)，加入瓊脂粉，加熱過程中不斷攪拌至充分溶解。 5）用 1mol/LNaOH 或 1mol/L 的 HCl 調(diào)節(jié) pH 值至 。 6）分裝，將配置好的培養(yǎng)基裝入三角瓶，封口。 7）高壓蒸汽滅菌， 121℃ 滅菌 20min。 （ 2）燕麥培養(yǎng)基的制備 1） 根據(jù)培養(yǎng)基配方，計(jì)算好各種成分的量及要求配置的總量，分別秤取或量取 燕麥片 30g，瓊脂粉 12g，加自來水至 1000 mL。 2） 在鍋內(nèi)加入 1000 mL 自來水煮沸，再加入 30g 燕麥片，攪拌均勻， 文火煮沸后計(jì)時 1h。 3） 趁熱用四層紗布過濾，將濾液用自來水定容至 1000 mL。 4） 再把濾液轉(zhuǎn)移至鍋內(nèi)，加入瓊脂粉并不 斷攪拌至瓊脂溶化。 5） 用 1mol/LNaOH 或 1mol/L 的 HCl 調(diào)節(jié) pH 值至 6） 分裝，將配置好的培養(yǎng)基裝入三角瓶，封口。 7） 高壓蒸汽滅菌， 121℃ 滅菌 20min。備用 （ 3） 花生葉汁 培養(yǎng)基的制備 1）根據(jù)培養(yǎng)基配方，計(jì)算好各種成分的量及要求配置的總量，分別秤取或量取 花生葉 ，馬鈴薯 200g，瓊脂 12g，葡萄糖 20g， 自來水定容至 1000 mL。 2） 將馬鈴薯切成 1cm 邊長的塊狀和洗凈的花生葉片一起加入蒸餾水中，文 13 火煮沸后計(jì)時 30min。 3）趁熱用四層紗布過濾，將濾液用蒸餾水定 容至 1000 mL。 4）再把濾液轉(zhuǎn)移至鍋內(nèi)，加入瓊脂粉，不停地?cái)嚢?，直至溶化? 5）再用 1mol/LNaOH 或 1mol/L 的 HCl 調(diào)節(jié) pH 值至 。 6）分裝，將配置好的培養(yǎng)基裝入三角瓶，封口。 7）高壓蒸汽滅菌， 121℃ 滅菌 20min。 培養(yǎng)條件設(shè)計(jì) 培養(yǎng)條件有三種，分別是光暗交替（ 12h/12h），黑暗，近紫外光，均置于 25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 病原菌產(chǎn)孢培養(yǎng)試驗(yàn)設(shè)計(jì) A 和 B 兩種病原菌的產(chǎn)孢培養(yǎng)方案如下表： 表 1 網(wǎng)斑病病原菌誘發(fā)產(chǎn)孢培養(yǎng)試驗(yàn)設(shè)計(jì) 光暗交替（ 12h/12h） 黑暗條件 近紫外光條件 玉米瓊脂培養(yǎng)基 （ 1） （ 2） （ 3） （ 1）