【文章內(nèi)容簡介】 切成若干塊 消毒 75%的酒精 %HgCl2消毒 35 分鐘，無菌水沖洗 45 次 培養(yǎng)基 誘導(dǎo)培養(yǎng)基： MS+6BA mg/ml +NAA mg/ml，蔗糖 %， 增殖培養(yǎng)基： MS+6BA mg/ml +NAA mg/ml，蔗糖 %， 誘根培養(yǎng)基： MS+NAA mg/ml，蔗糖 %， 接種 (每瓶 5 株 ) ↓ 25 天 ↓ 無菌操作 ↓ 芽的增殖 ↓ 根的誘導(dǎo)： 溫度 28177。2 ℃ ，光強(qiáng) 20203000 Lux， 每日光照 1012 小時 ↓ 生根率 85% 污染率 5% 試管苗 繁殖倍數(shù)在 3 左右 繼代培養(yǎng)周期： 60 天。 繼代培養(yǎng) （ 6 代） 煉苗 在誘根培養(yǎng) 18 天后，置于可控制光強(qiáng)的 遮蔭棚內(nèi)進(jìn)行煉苗，以達(dá)到壯苗的目的 移栽 培養(yǎng)袋 中的小苗，達(dá)到假莖高 45cm、具體 34 片以上的真葉和根系生長良好的規(guī)格時，即可在假植苗圃中移栽，培育達(dá)到杯苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，方可定植于大田 檢疫性病原檢測 對每一個外植體發(fā)生的不定芽進(jìn)行病毒檢測 商品苗 馬鈴薯脫毒及快速繁殖工藝流程圖 商品組培苗生產(chǎn)流程 商品苗的選擇 培養(yǎng)基的選擇及配置 誘導(dǎo)培養(yǎng)基： MS+6BA mg/ml +NAA mg/ml，蔗糖 %， 增殖培養(yǎng)基： MS+6BA mg/ml +NAA mg/ml，蔗糖 %， 誘根培養(yǎng)基： MS+NAA mg/ml，蔗糖 %， 、接種 外植體在接種前必須滅菌。在滅菌前，先在準(zhǔn)備室對外植體進(jìn)行預(yù)處理，去掉不需要的部分，將準(zhǔn)備使用的植物材料在流水中沖洗干凈。經(jīng)過預(yù)處理的植物材料，其表面仍有很多細(xì)菌和真菌，因此拿入接種室后還需進(jìn)一步滅 菌。 常規(guī)的表面滅菌處理方法是把材料放進(jìn) 75%的酒精中，約 30s 后用無菌水沖洗 1 次，再在 %的升汞（ HgCl2）中浸泡 3~5min，然后用無菌水沖洗 4~5 次。滅菌時進(jìn)行攪動，使植物材料與滅菌劑有良好的接觸。 接種是把經(jīng)過表面滅菌后的植物材料切碎或分離出器官、組織、細(xì)胞，轉(zhuǎn)放到無菌培養(yǎng)基上的全部操作過程。整個接種過程均須無菌操作。 （ 1）接種室用紫外燈照射滅菌 20~30 min，或提前 ~1 天用高錳酸鉀和甲醛混合液薰蒸。接種臺要提前開啟。 （ 2）工作人員進(jìn)入接種室前需用肥皂水洗 手滅菌，并在緩沖室換上已經(jīng)滅菌的白色工作服和拖鞋，戴工作帽和口罩。工作人員的呼吸也是污染的主要途徑，通常在平靜呼吸時細(xì)菌是很少的，但是談話或咳嗽時細(xì)菌便增多，頭皮屑也帶有細(xì)菌，因此操作過程應(yīng)禁止不必要的談話，并戴上帽子和口罩。 （ 3）進(jìn)入接種室后用 75%的酒精擦洗雙手、接種臺和一切需放上工作臺的所有器具，對外植體進(jìn)行滅菌處理。特別注意防止“雙重傳遞”的污染，例如器械被手污染后又污染培養(yǎng)基等。 （ 4）點(diǎn)燃酒精燈，將接種鉤、剪刀、鑷子放入不銹鋼盤或瓷盤內(nèi)燒灼，冷卻后備用。接種鉤、剪刀、鑷子等不使用時浸泡在 95%酒精中，用時在火焰上滅菌，待冷卻后使用。每次使用前均需進(jìn)行用具滅菌。 （ 5）將外植體放入經(jīng)燒灼滅菌的不銹鋼盤或瓷盤內(nèi)處理。如外植體為莖段的，將莖段上的葉柄和莖的上下端剪掉一小節(jié)；培養(yǎng)脫毒苗的，在雙筒解剖鏡下剝離切取大小約 ~ mm的莖尖分生組織。 （ 6）燒灼瓶口和塞子，將培養(yǎng)瓶傾斜拿穩(wěn)，打開塞子，用鑷子將接種材料送入瓶內(nèi)，用接種鉤將材料壓入培養(yǎng)基中，燒灼瓶口和塞子并上塞。在打開培養(yǎng)瓶、三角瓶或試管時，最大的污染危險是管口邊沿沾染的微生物落入管內(nèi)，燒灼是解決這個問題的有效辦法。如果培養(yǎng)液接觸了瓶口， 則瓶口要燒到足夠的熱度，以殺死存在的細(xì)菌。為避免灰塵污染瓶口，可用紙包扎瓶口和塞子，以遮蓋瓶子頸部和試管口，相對地減少污染機(jī)會。 接種后的外植體應(yīng)送到培養(yǎng)室去培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中既要調(diào)控好培養(yǎng)條件，又要注意防止發(fā)生菌類污染、外植體褐變和植株玻璃化現(xiàn)象，確保組織培養(yǎng)的成功。培養(yǎng)室的培養(yǎng)條件要根據(jù)植物對環(huán)境條件的不同需求進(jìn)行調(diào)控。其中最主要的是光照、溫度、濕度、氧氣等。 （ 1）光照 光照對離體培養(yǎng)物的生長發(fā)育具有重要的作用。通常對愈傷組織的誘導(dǎo)來說，暗培養(yǎng)比光培養(yǎng)更合適。但器官的分化 需要光照，并且隨著試管苗的生長，光照強(qiáng)度需要不斷地加強(qiáng)，才能使小苗生長健壯，并促進(jìn)它從“異養(yǎng)”向“自養(yǎng)”轉(zhuǎn)化，提高移植后的成活率。一般先暗培養(yǎng) 1 周， 1 周后每日光照10~12h，光照強(qiáng)度從 2020~3000lx 逐漸過渡。暗培養(yǎng)可用鋁箔或者適合的黑色材料（如黑色棉布）包裹在容器的周圍，或置于大紙箱和暗室中培養(yǎng)。 （ 2）溫度 離體培養(yǎng)中對溫度的調(diào)控要比光照顯得更為突出。不同的植物有不同的最適生長溫度。 馬鈴薯在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的溫度適應(yīng)范圍較寬，在 22℃～28℃都可以。但溫度過低，會使苗質(zhì)脆弱，生長速度延緩； 溫度過高培養(yǎng)基水分蒸發(fā)較快，致使植株還未分化到所需程度，就開始出現(xiàn)干萎。所以溫度最好24℃～ 26℃之間。 （ 3）氧氣 植物組織培養(yǎng)中，外植體的呼吸需要氧氣。在液體培養(yǎng)中，振蕩培養(yǎng)是解決通氣的有效辦法。在固體培養(yǎng)中，對于某些耗氧多的植物要采用通氣性好的瓶蓋、瓶塞，或用透氣膜封口。對于耗氧少的植物，組織培養(yǎng)中培養(yǎng)瓶內(nèi)能維持正常的氧氣和二氧化碳循環(huán)，用密封性好的封口材料更能有效地防止菌類污染。 （ 1）芽的增殖 外植體經(jīng)初代培養(yǎng)誘導(dǎo)出不帶菌的無菌芽。為了滿足規(guī)模生產(chǎn)的需要 ，當(dāng)試管苗長到 78 片葉時，必須通過不斷的繼代培養(yǎng)，使無菌芽大量增殖，培養(yǎng)出成千上萬的無菌芽。 繼代培養(yǎng)所用培養(yǎng)基可與初代培養(yǎng)基相同，也可根據(jù)可能出現(xiàn)的情況，逐漸地適量降低細(xì)胞分裂素的濃度，調(diào)整無機(jī)養(yǎng)分比例，或加入活性炭等，以防出現(xiàn)玻璃化或褐化現(xiàn)象。 繼代培養(yǎng)的接種過程與初代培養(yǎng)有兩點(diǎn)不同，一是不需要對接種材料進(jìn)行滅菌處理；二是在空間較大的培養(yǎng)瓶中接種，接種更方便。接種時，先將外植體上的無菌芽剪下，或?qū)⒁牙^代過的叢狀無菌芽分開。較長的無菌芽可剪成幾段接種，但必須保證每一段上至少有一個節(jié)。接著用鑷子將剪好的接 種材料放入培養(yǎng)瓶中，再用接種鉤撥動使材料在瓶中均勻分布，最后將接種材料的下端壓入培養(yǎng)基中。除此以外，斷代培養(yǎng)的接種過程和要求與初代培養(yǎng)相同，同樣必須確保無菌操作。 繼代培養(yǎng)期間培養(yǎng)室環(huán)境條件的控制，除了不需要暗培養(yǎng)外，光照、溫度、濕度和通氣條件的控制與初代培養(yǎng)基本相同。要注意根據(jù)繼代苗出現(xiàn)的情況，調(diào)節(jié)光照、溫度、濕度和通氣條件，或及時轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，防止產(chǎn)生褐化現(xiàn)象和玻璃化現(xiàn)象。 （ 2）根的誘導(dǎo) 與繼代培養(yǎng)基和初代培養(yǎng)基相比，生根培養(yǎng)基有個三特點(diǎn)。 ①無機(jī)鹽濃度較低。 一般認(rèn)為，礦質(zhì)元素濃度高時有利于發(fā) 展莖葉，較低時有利于生根，所以生根培養(yǎng)時一般選用無機(jī)鹽濃度較低的培養(yǎng)基配方。用無機(jī)鹽濃度較高的培養(yǎng)基配方時，應(yīng)稀釋一定的倍數(shù)。如使用 MS 培養(yǎng)基，在生根誘導(dǎo)培養(yǎng)中多采用 1/2MS或 1/4MS。 ②細(xì)胞分裂素少或無。 生根培養(yǎng)基一般要完全去除或僅用很低濃度的細(xì)胞分裂素，并加入適量的生長素，最常用的生長素是 NAA。 ③糖濃度較低。在生根階段，培養(yǎng)基中的糖濃度要降低到 ~%，以促進(jìn)植株增強(qiáng)自養(yǎng)能力，有利于完整植株的形成和生長。 （ 1）組培苗的煉苗 將瓶苗移出培養(yǎng)室，放 在準(zhǔn)備室內(nèi)，打開瓶口封口，將瓶苗室溫放置 2 一3d 后，進(jìn)行移栽。將實(shí)驗田翻耕，使耕作層土層疏松，整理出畦。在土壤上面鋪一層約 5cm 的蛙石，澆透水。將小拱棚支架搭好備用。將雙斜面小棚打成屋脊?fàn)罨蛉切?，拱棚南北走向，中間設(shè)一條拉桿，可起到堅固抗風(fēng)的作用閣。一般棚內(nèi)相對濕度可達(dá) 70%100%，白天通風(fēng)時，棚內(nèi)相對濕度可保持在 40％一60 %；夜間密閉時可達(dá)到 90％以上。棚內(nèi)地溫比露地高 5一 6℃，有利于再生苗的生長和提高再生苗成活率。當(dāng)瓶苗根長至 2cm 左右時，用鑷子輕輕取出，用流水將瓶苗根部的培養(yǎng)基沖洗干凈，然 后栽在準(zhǔn)備好的蛙石中，隨后用噴壺澆一遍透水，將棚膜罩上，以水壓邊。白天氣溫過 30℃時用遮陽網(wǎng)遮蔭。馴化過程中通過通風(fēng)、遮蔭、灑水使棚內(nèi)溫度白天保持在 25℃左右。待白天氣溫穩(wěn)定在 28℃以上，生了新根約 3cm時，可去膜移栽。 （ 2）組培苗的移栽 煉苗后將苗木取出，洗去培養(yǎng)基，移栽到無菌的混合土中，保持一定的溫度和水分，長出 2~3 片新葉時移栽到田間或盆缽中。 第五章 工藝計算 生產(chǎn)規(guī)模與生產(chǎn)計劃計算 生產(chǎn)規(guī)模的確定： 生產(chǎn)規(guī)模為年產(chǎn) 500 萬馬鈴薯脫毒苗。 試管苗規(guī)模的確定 ： 年產(chǎn) 500 萬組培商品苗，主要考慮三個方面：增殖，生根，馴化。 經(jīng)過在網(wǎng)上查閱相應(yīng)馬鈴薯的生長周期及相關(guān)的一些組培技術(shù)的整理，知道馬鈴薯從培育、誘導(dǎo)到成苗（約 1520cm）需要 25 天，初代、繼代擴(kuò)培需要 15天。所以每一次繁殖周期取 2 個月，整個過程中，母株制備過程成活率 85%，有效