【文章內(nèi)容簡介】 在 4℃輕搖 1h； 6. 加入 60ul Protein A Agarose/SalmonSperm DNA(50% Slurry) 在 4 攝氏度搖晃 1小時。（非陰性對照）； 7. 輕微離心， 7001000g 1min，小心去除上清，依次用以下洗液清洗沉淀。（分別加入 1mL 在 4℃輕搖 35min） (a) Low Salt Immune Complex Wash Buffer, 洗滌一次 (b) High Salt Immune Complex Wash Buffer，洗滌一次 (c) LiCl Immune Complex Wash Buffer, 洗滌一次 (d) TE Buffer,洗滌兩次 接下來可作 PCR 反應(yīng) 解交聯(lián) 1. 現(xiàn)配 elution buffer(1% SDS, NaHCO3)。 2. 加入 250ul elution buffer 洗脫組蛋白復(fù)合物。輕微旋轉(zhuǎn)混勻并在室溫?fù)u晃 15 分鐘。沉淀 agarose 并小心將上清加入新管。再重復(fù)洗脫一次。（共 500ul）。 3. 加入 20ul 5M NaCl，在 65 度加熱 4 小時進行 reverse crosslink。注意此時同時做input Sample。 4. 加入 10ul EDTA, 20ul 1M TrisHCl, and 2ul 10mg/mL Proteinase K 并且在 45 度保溫 1 小時。 5. 純化回收 DNA，接下來可進行 WGA2。 全基因組擴增 本實驗所采用的是 SIGMA， Cata： WGA2， GenomePlex○R Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit 。實驗步驟如下： Random Fragmentation (1) Isolate DNA sample and quantify concentration by UV absorption (260nm).Prepare DNA solution of 1 ng/181。l. (2) Add 1 181。l of 10 Fragmentation Buffer to 10 181。l DNA (1 ng/181。l) in a PCR tube or multiwell strip/plate. (3) Place the tube in a thermal or cycler at 94 176。C for EXACTLY 4 minutes. Gli1在 IHH信號通路中信號靶點的體內(nèi)分析 14 Note: The incubation is time sensitive and any deviation may alter results. (4) Immediately cool the sample on ice and centrifuge briefly Library Preparation (5) Add 2 181。l of 1 Library Preparation Buffer to each sample. (6) Add 1 181。l of Library Stabilization Solution. (7) Vortex thoroughly,consolidate by centrifugation and place in thermal cycler at 95 176。C for 2 minutes. (8) Cool the sample on ice,consolidate by centrifugation and return to ice. (9) Add 1 ml of Library Preparation Enzyme, votex thoroughly, and centrifuge briefly. (10) Place sample in thermal cycler and incubate as follows: 16 176。C 20 minutes 24 176。C 20 minutes 37 176。C 20 minutes 75 176。C 5 minutes 4 176。C (11) Remove samples from thermal cycler and centrifuge briefly. Samples may be amplified immediately or stored at –20 176。C for up to three days. Whole Genome Amplification (12) A master mix may be prepared by adding the following reagents to the entire 15 181。l reaction from step 11: 181。l 10 Amplification Master Mix 181。l Nuclease Free Water 181。l WGA DNA Polymerase for WGA2 (13) vortex thoroughly, centrifuge briefly, and begin following profie has been optomized for PE9700 or equicanlent thermocycler: Initial Denaturation 95 176。C for 3 minutes Perform 14 cycles as follows: Denature 94 176。C for 15 seconds Anneal/Extend 65 176。C for 5 minutes After cycling is plete, maintain the reactions at 4 176。C or store at –20 176。C until ready for analysis or purification. Reversetranscription PCR, 反轉(zhuǎn)錄 PCR，用依賴于 RNA 的 DNA 聚合酶進行 cDNAGli1在 IHH信號通路中信號靶點的體內(nèi)分析 15 第一鏈的合成。因此先來介紹 RNA 的獲得。 extraction 由于 RNA 不穩(wěn)定，極易降解，且空氣當(dāng)中含有大量的 RNase，因此要求整個操作過程以及涉及的試劑，消耗品等需進行去 RNase 處理，處理的方法一般有兩種： RNase酶很穩(wěn)定，普通的滅菌溫度是對它沒有作用的，如果采用溫度處理，則在 200176。C 環(huán)境下，至少處理 2 小時；另一種就是常用的保險方法，即用 % DEPC 水進行處理后，再 200176。C 烘干即可 (DEP 水的配置，在去離子水里加入 DEPC,終濃度 %, 37176。C shake O/N 后，滅菌處理以滅活 DEPC)。 RNA 抽提采用的是 invitrogen 的 Trizol 試劑， Cata： 15596。實驗步驟如下： 1. 用 1 PBS 將細(xì)胞洗滌兩遍； 2. 加入 800ul Trizol 于細(xì)胞孔內(nèi) , 于 RT 室溫哺育 510 分鐘 ,在這個過程里 ,可以用槍頭對孔內(nèi)的細(xì)胞進行吹打利于混勻的進行； Types of plate 35cm2 12well 24well 備注 Trizol added 1ml 800ul 500ul Trizol:Chloro=體積比 =5:1 Trizol:Isopro=體積比 =2:1 Trizol:Ethanol=體積比 =1:1 Chloroform added 200ul 160ul 100ul Isopropylalcohol added 500ul 400ul 250ul 75% ethanol 1ml 800ul 500ul 3. 按上表加入對應(yīng)體積的氯仿 ,蓋子蓋嚴(yán)實 ,Vortexing 15s, RT 放置 23 分鐘； 4. (建議在 48℃做 )12021rpm, 離心 15min (液體分為 3 層 , aqueous phase, phenolchloroform phase (紅色 )and an interfase、 RNA 處于 aqueous phase 中 , 體積大概為所加 Trizol 的 60%)； 5. 小心翼翼的將上清移入一新鮮的 eppendorf 管內(nèi) (所剩紅色液體層可繼續(xù)用于后續(xù) DNA/蛋白的提取 ), 按照上表加入對應(yīng)體積的異丙醇 ,蝸旋振蕩后 ,RT 放置 10分鐘； 6. (建議在 48℃做 )12021g, 離心 10min 后 , 所得的目的 RNA 存在于管底； 7. 小心棄去上清后 ,按上表加入對應(yīng)體積的 75%酒精 , Vortexing 15s, 7500g離心 5分鐘 ,重復(fù)該操作一次； 8. 小心棄去上清后 , 倒置干燥 2030 分鐘 (避免干燥過頭而影響 RNA 的溶解 )； 9. 每管加入 4050ul DEPC 水溶解 RNA,輕微 Vortexing 和離心后 ,置于 5565 度環(huán)境10 分鐘； 10. 70℃保存； 11. 長期保存方案 : 置于 75%酒精中 ,20 或 70℃可維持一年； 第一鏈合成 Gli1在 IHH信號通路中信號靶點的體內(nèi)分析 16 合成完整的 cDNA 鏈的一個重要因素就是分離到完整的總 RNA， RNA 的質(zhì)量直接就決定了最后被反轉(zhuǎn)錄為 cDNA 后所包含的序列信息。因此在整個 RNA 制備過程當(dāng)中，必須時刻有著一個防止 RNase 污染的概念。本實驗所采用的是 invitrogen,Cata：18080051， Superscript FirstStrand Synthesis System for RTPCR。實驗步驟如下 (如圖 31所示 )： 1. Mix and briefly centrifuge each ponent before use. 2. Prepare RNA/primer mixtures in sterile or tubes as follows: Component Amount RNA 8ul 10mM dNTP mix 1ul Primer:50 181。M oligo(dT)20, or2 181。M genespecific primer (GSP), or50 ng/181。l random hexamers 1ul DEPCwater ―― Total Volumn 10ul 3. Incubate each sample at 65℃ for 5 min, then place on ice for at least 1 min. 4. Prepare the following reaction mixture, adding each ponent in the indicated order. (For n samples + 1 minus RT control and 1 Control RNA reaction, prepare the reaction mix for n +3 reactions.) Component Each reaction 10reaction 10*RT buffer 2ul 20ul 25mM MgCl2 4ul 40ul DTT 2ul 20ul RNaseOUT(40 U/181。l) 1ul 10ul SuperScriptIII RT (200 U/181。l) 1ul 10ul 5. Add 10 181。l of cDNA Synthesis Mix to each RNA/primer mixture,mix gently, and collect by brief as follows. Oligo(dT)20 or GSP primed:50 min at 50176。C Random hexamer primed: 10 min at 25176。C, followed by50 min at 50176。C Incubate at 42176。C for 2 min. 6. Terminate the reactions at 85176。C for 5 on ice. 7. Collect the reactions by brief centrifugation. Add 1 181。l of RNase H to each tube and incubate for 20 min at 37176。C. 8. cDNA synthesis reaction can be stored at 20176。C or used for PCR immediately. Gli1在 IHH信號通路中信號靶點的體內(nèi)分析 17 圖 31 cDNA 第一鏈合成步驟示意圖 關(guān)于反轉(zhuǎn)錄引物的選擇 反轉(zhuǎn)錄引物一般有三種， Ra