【正文】 代謝后減毒的藥物表現(xiàn)毒性較強。同時，它可以為長期毒性試驗、生殖毒性試驗、致突變試驗等試驗設計提供劑量選擇依據(jù)和有關毒性信息，還可以推測受試藥物毒性發(fā)生的速度和持續(xù)時間，與半數(shù)有效量(ED50)比較判斷新藥的安全系數(shù)。 二、試驗準備 實驗應在符合 GLP的實驗室內進行，實驗樣品質量和穩(wěn)定性應符合要求，與藥效學及臨床試驗一致。以后 1日至少觀察 1次，觀察 7 日觀察癥狀包括①行動：不安定、多動、發(fā)聲；②神經(jīng)系統(tǒng)反應：舉尾、振顫、痙攣、運動失調、姿態(tài)異常；③自主神經(jīng)系統(tǒng)反應：眼球突出、流涎、流汨、排尿、下瀉、豎毛、皮膚變色、呼吸；④死亡。購入動物試驗前應馴化 1星期，隨機或按體重分組，每組 10只以上，雌雄各半，分別編號，給藥前應禁食 (不禁水 )過夜?；虿捎脛┝坷鄯e法，同一批動物間隔一定時間、劑量由小到大給藥，觀察毒性反應，同時結合血藥濃度的測定，確定動物的急性毒性反應、靶器官、中毒或致死劑量、毒性反應時的血藥濃度。各組平均體重相似，體重變異不超過 20％。 (6)食物應清潔，無霉變：食物中的脂肪、蛋白質、碳水化合物等營養(yǎng)成分要符合各種動物的生理需求目恒定，因有時營養(yǎng)成分對藥物的毒性也有很大的影響。 三、動物規(guī)格和數(shù)量 長期毒性實驗一般由雌雄各半、健康無病、檢疫合格的動物組成。室內飼養(yǎng)另種動物，或其他飼養(yǎng)條件的突然改變，均可引起實驗動物應激反應，從而影響毒性實驗結果。犬等大動物常采用口服或摻飼給藥。 1星期以上者及需反復應用的藥物，可選用大鼠進行長期毒性實驗。反應骨髓造血功能，外周各類血細胞的受損或活動情況，凝血機制的影響程度等。 (10)總膽固醇 (T— CHO)：增高見于代謝減退，脂類動員增加等。 皮膚黏膜用藥的毒性試驗 皮膚黏膜用藥即局部用藥，包括皮膚用藥、直腸或陰道給藥、滴眼藥、滴鼻藥、滴耳劑、吸入劑及口腔咽喉用藥等。 1．劑量設置 (1)如果受試物毒性較大．預試驗時提高劑量可使大部分動物死亡，應按全身給藥的原則，沒置幾個劑量組 (完整皮膚組和破損皮膚組備數(shù)個劑量組 )。 三、觀察記錄與檢查 除去受試物后每日觀察至第七日，記錄動物的體重、皮膚毛發(fā)、眼和黏膜的變化，中毒表現(xiàn)的觀察項與全身給藥的急性毒性實驗相同。 受試物劑量應以同面積不同濃度為宜。給藥區(qū)涂抹受試物 (固體 )或 1ml(液體 )，對照區(qū)涂以等量賦形劑，二層紗布覆蓋，適當方法固定。 14日后，在動物背部另一側，試驗組涂敷受試物，陰性對照組涂敷賦形劑，陽性對照組涂敷 o． 1％ DNCB(或其他陽性對照藥 )。② 1星期后，皮內注射部位涂敷含 10％月桂醇硫酸鈉的凡士林液。 四、注意事項及結果評價 1．注意事項 實驗動物的選擇同皮膚過敏性試驗。如賦形劑有刺激性，應再設空白對照組。 凡臨床用藥超過 1星期的受試物，要進行多次給藥的刺激性試驗，與單次給藥方法相同，連續(xù)給藥 1星期或以上。保證受試物與黏膜接觸 4h以上。 二、陽性對照 6— 甲基香豆素、 3， 3’， 4’， 5— 四氯水楊酸苯胺等。⑥在同一部位包封式涂敷受試物 (0． 2ml或 0， 1g)致敏，保持 48h。必要時應能陳述所用劑量的理由。 三、試驗方法 至少用 3只家兔或 5只豚鼠。 2 給藥方法 受試物如為膏劑或液體劑型，可直接涂抹于去毛皮膚上；固體粉末或中藥散劑，需加適量水或其他賦形劑 (如羊毛脂、凡士林、橄欖油等 )混合均勻，以保證受試物與皮膚接觸良好， 藥物涂抹后應以適當?shù)牧Ψü潭?，如用無刺激性紗布、膠布或有孔尼龍繃帶固定；豚鼠或大鼠可用剪去指套的乳膠手套包住整個背部和腹部；如受試物是液體，應先覆以聚乙烯薄膜，防液體揮發(fā)。如采用其他方法，應說明理由。保證受試物與黏膜接觸 4h以上。剖取的實質性臟器應稱重。其濃度增高見于脫水及血液濃縮。對可能影響飲水量、尿量的受試藥物，或摻入飲水紿藥時，應測定攝水量。如賦形劑或溶劑可能產生毒性時，還需另設空白對照組。 皮下注射，大鼠每 l00g體重不超過 1ml，小鼠為 0． 1— 0． 3ml／ l0g(體重 )。濕度是種潛熱，宜控制在 30％ — 70％。既易得、易養(yǎng)、易于操作，又接近實際用藥人群的基因組成情況。溫度、濕度的突然變化，體溫雖然變化不大，但并不意味著動物的生理狀況未受影響，同樣可以導致動物對外環(huán)境變化的抵抗力降低，影響毒性實驗結果。如果急性毒性試驗與長期毒性試驗采用同種動物，則急性毒性試驗的劑量對長毒有更大的參考價伉。 三、近似致死量試驗 國外近年來有采用少量動物進行近似致死量測定的方法?？捎么苹蛐坌詣游?，設四組以上，每組 34只，先用 1； 10的劑量比給藥 (如 5mg／ kg、50mg／ kg、 500mg／ kg、 5000mg／ kg固定劑量 )。大鼠口服最大容量不超過 2ml／ l00g(體重 )，其他途徑不超過 lml／ l00g(體重 )。最小致死量或半數(shù)致死量，小動物 (大鼠、小鼠 )試驗組在三組以上，每組 — 般至少 10只動物 (雌雄各半 )。急性毒性試驗 急性毒性試驗 (單次給藥毒性試驗 )主要觀察對實驗動物一次給藥后所產生的毒性癥狀及其程度，出現(xiàn)和消失的時間，死亡的發(fā)生率并計算出其最大給藥量，最小致死量、半數(shù)致死量 (LD50)等。一些國家對動物數(shù)和組數(shù)不作規(guī)定，因此，有只用 3只一組經(jīng)多組試驗測得近似致死量或 LD50者。 四、急毒試驗觀察指標和致死量的計算 (一 )觀察指標 不能把求得致死劑量看作是急性毒性實驗的唯一要求。觀察 7日，記錄死亡動物數(shù)。其中有的類似LD50的預試驗或霍恩氏法。即使如此，還應考慮該藥的蓄積作用。 (5)室內噪聲最好在 50dB以下：雌雄分養(yǎng)，不宜擁擠，必要時 (如摻飼給藥或需精確測定飲食量時 )單籠飼養(yǎng)，但要注意單養(yǎng)和群養(yǎng)的動物劉藥物的反應是有差異的。除非有特殊目的，一般不用近親繁殖的動物。溫度、濕度的突然變化，體溫雖然變化不大，但并不意味著動物的生理狀況未受影響，同樣可以導致動物對外環(huán)境變化的抵抗力降低，影響毒性實驗結果。肌內注射，大鼠每腿不超過 0． 5ml，小鼠每腿不超過 0． 3ml。 四、給藥周期 不應少于臨床療程的 1倍。 (5)死亡，是中毒最明顯的表現(xiàn)，但須注意與自然死亡或意外死亡的區(qū)別．應及時進行剖檢和記錄。 (8)球蛋白：常見是其濃度增高，反應受到感染或機體免疫功能亢進。 (4)病理切片原則亦應盡量廣泛。 需設賦形劑對照組。 3．給藥周期 皮膚黏膜用藥的急性毒性試驗時，受試物與皮膚或黏膜接觸不超過 24h。同時要注意防試驗動物舔食受試物。給藥前 24h，動物背部去毛。 四、試驗方法 給受試物 (致敏或激發(fā) )前 24h，動物頸背部兩側脫毛， — 側用于致敏涂敷，另 — 側用激發(fā)涂敷。⑦致敏結束 2期后，在背部或側腹脫毛處，敞開式涂敷受試物激發(fā)。 三、受試物 受試物如為膏劑或液體劑型，可直接涂抹于去毛皮膚；如是固體粉末或中藥散劑，需加適量水或其他賦形刑 (如羊毛脂、凡士林、橄欖抽等 )混合均勻，以保證受試物與皮膚接觸良好。如盲腸或陰道或滴鼻或吸入用藥時，可將動物固定；口腔用藥時，可將藥物涂抹在下唇與齒齦之間；或提高受試物的黏稠度；或增加用藥次數(shù)。 。 需設賦形劑對照組。必要時應能陳述所用劑量的理由。 2 . 最大限度試驗法 ①頸背部脫毛區(qū)左右對稱皮內注射燕餾水和福氏完全佐劑 (1： 1)乳化劑 (油包水， W／ O)0． 1ml．受試物 0． 1ml，受試物和 FCA乳化劑 0． 1ml。試驗組動物背部 側脫毛處涂敷受式物，陰性對照組動物背部．脫毛處涂敷賦形劑，陽性對照組動物背部一側脫毛處涂敷 1％ DNCB(或其他陽性對照藥 )，均持續(xù) 6h動物分籠飼養(yǎng)。破損皮膚制造方法、給藥和固定方法等同皮膚毒性試驗。目的足要保證受試物與黏膜接觸4h以上。給約 24h后，用溫水或無刺激溶劑除去殘留受試物。 (三 )受試藥 原則上盡量與臨床用制劑一致，并保證受試物與皮膚接觸良好。實際操作中可先對高劑量組動物及尸解發(fā)現(xiàn)異常器官進行重點切片檢查，在高劑量組發(fā)現(xiàn)有異常病變時再進行詳細檢查。