【正文】 變情況。有毒性反應、體重減輕或臟器有病變的動物應在剖檢后立即進行主要臟器的病理組織學觀察。 LD50和最小致死量及其可信限的汁算可采用 Bliss法，改進寇氏法、點斜法、簡化概率單位法或其他的計算方法。汁算結果對比表明，不同的汁算方法，結果間一般無明顯差異，而不同實驗室對同一樣品試驗結果卻常見有顯著差異。岡此，采用較簡單的計算方法完全可以滿足 LD50計算的準確性。 二、最大給藥量試驗 如同受試藥物的濃度或體積限制，無法測出半數(shù)致死量 (LD50)時，作最大給藥量試驗。試驗選用擬推薦臨床試驗的給藥途徑，以動物能耐受的最大濃度 (溶液仍有較好的流動性 )，最大體積的給藥量 1次或 1日內 2～ 3次給予動物。以小鼠口服為例：動物數(shù)不得少于 20只，雌雄各半，容量 — 次不超過 0． 4ml/10g(體重 )，多次給藥間隔時間不低于 4h，觀察 7日，汜錄毒性反應和體重變化。如仍未見毒性反應或體重正常增加，則可認為該藥物小鼠最大給藥量未見毒性反應，或 LD50大于最大給藥量。經(jīng)統(tǒng)計學計算，該劑量不可能大于 LD14。如用 10只動物未見毒性反應或死亡則該劑量不可能大于 LD26。 三、近似致死量試驗 國外近年來有采用少量動物進行近似致死量測定的方法。其中有的類似LD50的預試驗或霍恩氏法。每組用 3— 4只動物，設多組，詳細觀察并汜錄動物毒性反應井進行血液學，血液生化以及病理組織學觀察。有的采用劑量遞增法即 — 只動物一個劑量以幾何級數(shù)遞增，根據(jù)前個劑量的反應，決定下 — 個劑量?；虿捎脛┝坷鄯e法，同一批動物間隔一定時間、劑量由小到大給藥，觀察毒性反應，同時結合血藥濃度的測定，確定動物的急性毒性反應、靶器官、中毒或致死劑量、毒性反應時的血藥濃度。劑量遞增法類似于 LD50測定的階梯法 (或稱序貫法、上下法 )，適用小動物而且毒性反應出現(xiàn)快的試驗， 10— 20只動物即可測定。劑量累積法則適用大動物，利用大約 6只合格動物即可進行急性毒性試驗的全面觀察。另外，國外還有采用固定劑量給藥觀察近似致死劑量，以決定藥物毒性大小者。 四、急毒試驗結果評價 (一 )可靠性評價 為保證急毒結果，實驗條件應符合 GLP的要求，供試品質量穩(wěn)定，動物合格，實驗方案，實驗原始記錄，標準操作規(guī)程，總結報告應符合要求?？偨Y報告中應包括摘要、供試品、試驗動物，試驗環(huán)境、給藥方法、觀察方法、毒性反應癥狀、體重變化、病理組織學變化、雄性反應和死亡出現(xiàn)的時間、 LD50和 LD5及其可信限的計算方法、結果討論等。根據(jù)試驗結果對急性毒性進行全面評價。 (二 )安全性評價 (1)根據(jù)急性毒性試驗結果判斷供試藥物毒性的強弱、類型。國內尚無統(tǒng) — 規(guī)定。 (2)急性毒性試驗結果對臨床研究有指導意義，可以為臨床研究時探索安全有效劑量避免出現(xiàn)急性不良反應提供依據(jù)。 但是，鑒于人體與各種動物對各類化合物的吸收、分布、代謝、排泄以及各類型毒性反應的差異，尚無規(guī)律可循，現(xiàn)有化學藥品統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，在進行臨床研究時，仍應根據(jù)實驗結果參考文獻資料報道進行由低到高的安全治療劑量的探索。 (3)急性毒性試驗結果對推測長期毒性試驗劑量具重要意義，、不同種動物之間的差異，急性毒性結果無論用體重劑量還是體表面積劑量計算常見有差異而尚無規(guī)律。如果急性毒性試驗與長期毒性試驗采用同種動物，則急性毒性試驗的劑量對長毒有更大的參考價伉。即使如此，還應考慮該藥的蓄積作用。不同種動物間雖然也可以進行劑量推測但僅可作為參考．仍需要長期毒性試驗前進行必要的預試驗。 三、動物規(guī)格和數(shù)量 長期毒性實驗一般由雌雄各半、健康無病、檢疫合格的動物組成。各組平均體重相似，體重變異不超過 20％。對照組動物數(shù)，可以與給藥組相同，也可按公式計算：對照組動物數(shù)：給藥組動物數(shù) x劑量組數(shù)的平方根。 試驗周期 3個月之內的，嚙齒類宜用 6— 8周齡的大鼠，每組數(shù)量不少于20只；非嚙齒類可用 6— 10月齡的犬，每組數(shù)量 6只；試驗周期 3個月以上的，嚙齒類宜用 6周齡的大鼠，每組數(shù)量應增至 3040只。非嚙齒類可用 46月齡的犬，每組數(shù)量 6只。確定每組動物數(shù)的原則，主要考慮藥物毒性致實驗動物死亡數(shù)，實驗中處死動物的批次和實驗結束時及停藥后觀察恢復狀況所需能用于統(tǒng)計分析的動物數(shù)。 四、飼養(yǎng)條件 (1)通風良好：動物飼養(yǎng)室的換氣次數(shù)和氣流速度能控制在 10～ 15次／ h和 13—18cm／ s較好，目的是利于動物的散熱及排除臭氣、粉塵和微生物，又不明顯影響室內的溫、濕度和動物的耗能。 (2)光照規(guī)律：因生物節(jié)律對動物的反應性有明顯的影響，光照會影響動物的生物節(jié)律從而影響不同批次之間的毒性對比。大鼠、小鼠應為 12h明， 12h暗；倉鼠應是 14h明， l0h暗。 (3)環(huán)境清潔：微生物或寄生蟲感染等，均叫能影響毒性試驗的結果。有條件者應盡可能選用清潔級、 SPF級試驗設施。 (4)溫、濕度適中且穩(wěn)定：常溫動物在 15— 33C下，體溫波動在 1. 5C以內。濕度是種潛熱，宜控制在 30％ — 70％。溫度、濕度的突然變化，體溫雖然變化不大，但并不意味著動物的生理狀況未受影響，同樣可以導致動物對外環(huán)境變化的抵抗力降低，影響毒性實驗結果。 (5)室內噪聲最好在 50dB以下：雌雄分養(yǎng)，不宜擁擠，必要時 (如摻飼給藥或需精確測定飲食量時 )單籠飼養(yǎng)，但要注意單養(yǎng)和群養(yǎng)的動物劉藥物的反應是有差異的。各劑量組和對照組的飼養(yǎng)條件應等同。室內飼養(yǎng)另種動物，或其他飼養(yǎng)條件的突然改變，均可引起實驗動物應激反應，從而影響毒性實驗結果。 (6)食物應清潔，無霉變：食物中的脂肪、蛋白質、碳水化合物等營養(yǎng)成分要符合各種動物的生理需求目恒定，因有時營養(yǎng)成分對藥物的毒性也有很大的影響。飲水要潔凈，防止病源微生物、重金屬或其他有毒物質的污染。 長期毒性實驗 本書的長期毒性實驗與國際現(xiàn)行的反復給藥的毒性實驗概念是基本一致的，包含了過去“亞急性毒性實驗”、“亞慢性毒性實驗”、“慢性毒性實驗”及“終身毒性實驗”等稱謂。 長期毒性實驗的主要目的有： — 是觀察藥物在選定時間內反復給予動物的情況下，動物出現(xiàn)損害的靶組織或器官及劑量 — 效應關系和可逆性等；二是了解實驗動物對藥物能耐受的劑量范圍和對人來說可能無毒的安全劑量。 組成長期毒性實驗的三個主要部分是實驗動物、受試藥物和觀察指標。長期毒性試驗贊時、費力，故必須根據(jù)新藥類別、受試物性質和用途、療程長短、急性毒性試驗和長期毒性預試驗結果等周密考慮，精心設計，以避免難以彌補的缺失。長期毒性試驗設計一般需要重點考慮以下幾個方面。 第一節(jié) 實驗動物 一、動物種類 (1)我國對中藥三、四類新藥，處方中各味藥材均符合法定標準，無毒性藥材，無十八反、十九畏等配伍禁忌，又未經(jīng)化學處理 (水、乙醇粗提者除外 )，難以測出 LD50，而給藥量大于 20g(生藥 )／ kg(體重 )，臨床用藥期為 1星期以內者可免做長期毒性實驗。 (2)符合上述條件，用藥 1星期以上者及需反復應用的藥物，規(guī)定可只選用大鼠進行長期毒性實驗。 (3)對一、二類新藥以及含有毒藥材、非法定標準藥材，或有十八反、十九畏等配伍禁忌的三、四類中藥新藥，我國及各國藥政部門普遍規(guī)定，長期毒性實驗應用嚙齒類和非嚙齒類二種動物進行。嚙齒類中，大鼠公認為首選動物，其次是小鼠、地鼠或豚鼠等；非嚙齒類中，常用的是犬，也可根據(jù)需要選用猴、貓、兔或小型豬等。 二、動物品系 實驗應選用封閉群動物，如嚙齒類的 Wistar或 Sprague Dewley品系大鼠，非嚙齒類的 Beagle犬。既易得、易養(yǎng)、易于操作，又接近實際用藥人群的基因組成情況。除非有特殊目的，一般不用近親繁殖的動物。也有認為雜交第一代鼠兼有對藥物反應波動少和接近人群基因組成情況的優(yōu)點而提倡選用的，尚未被普遍接受。由于不同國家、不同實驗室的動物經(jīng)過長期傳代，其品系基因已發(fā)生了很大的變化，因此長期毒性實驗動物必須來源清楚，并有繁殖生產(chǎn)合格證號。 三、動物規(guī)格和數(shù)量 長期毒性實驗一般由雌雄各半、健康無病、檢疫合格的動物組成。各組平均體重相似，體重變異不超過 20％。對照組動物數(shù)，可以與給藥組相同，也可按公式計算：對