【正文】 ....................IABSTRACT（英文摘要） ............................................II目 錄 ..........................................................IV第一章 引 言 ...................................................1 課題研究的背景及意義 ......................................1 渦蟲研究進展 ..............................................2 ..............................................2 ........................................4 ..........................................4 ..............................................5 ..............................................6 十二烷基硫酸鈉研究概況 ....................................7 ............................7 ................................................7(SOD) ...................................7(CAT) .......................................8（POD） .....................................9 ........................................9第二章 實驗方法 .................................................11 實驗材料、試劑及儀器 .....................................11 實驗材料 .............................................11 主要試劑及藥品 .......................................11 主要實驗儀器及設(shè)備 ...................................12 試劑的配制 ...............................................12 實驗材料的獲取 ...........................................13 渦蟲采集方法 .........................................13 渦蟲培養(yǎng)方法 .........................................14 渦蟲再生脅迫培養(yǎng) .......................................14 渦蟲上清液的提取 .....................................15 ...............................15 .............................................15 .....................................15 .................................16 CAT酶活力測定 ...........................................17 .............................................17 .............................................17 CAT活力計算 .........................................18 SOD酶活力測定 ...........................................18 實驗原理 .............................................18 實驗方法 .............................................18 結(jié)果計算 .............................................20 .............................................20第三章 結(jié)果與討論 ..............................................21 蛋白標準曲線制作 .........................................21 CAT酶活測定 .............................................22 CAT酶活測定數(shù)值 .....................................22 再生不同天數(shù) CAT酶活隨 SDS濃度變化 ...................23 不同 SDS濃度下 CAT酶活隨再生天數(shù)變化 .................26 SOD酶活測定 .............................................27 SOD酶活測定數(shù)值 .....................................27 再生不同天數(shù) SOD酶活隨 SDS濃度變化 ...................28 不同 SDS濃度下 SOD酶活隨再生天數(shù)變化 .................31結(jié) 論 ............................................................33參考文獻 ........................................................34致謝及聲明 ......................................................37附件………………………………………………………………………………38第一章 引 言 課題研究的背景及意義 淡水渦蟲是扁形動物門和渦蟲綱的代表，它是動物界兩胚層輻射對稱進化到三胚層兩側(cè)對稱的初級階段，是再生作用、胚胎發(fā)育、行為等生物學研究的理想材料，是國際動物界熱衷探索的項目。在動物演化的歷史進程中,扁形動物門的出現(xiàn),標志著動物界的演化發(fā)展已由水生向陸生、由固著或漂浮生活向自由爬行生活過渡,并在形態(tài)演化上相應(yīng)出現(xiàn)了一系列發(fā)展水平上關(guān)鍵性的變化。如旋渦蟲（Convluat）。目前一般認為原卵巢渦蟲類是低等的種類，新卵巢渦蟲類是較為進化的種類。東亞三角頭渦蟲對水質(zhì)敏感 [14]，受到污染的水域一般見不到渦蟲。無性橫裂生殖適宜的溫度范圍是 18～29 ℃,生殖的速度隨溫度的生高而加快。 抗氧化物酶抗氧化系統(tǒng)是機體清除體內(nèi)多余的活性氧、保護自身免受氧化損傷的重要體系，其中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、過氧化物酶（POD）起主要作用 [28]。在哺乳動物以肝和腎臟 CAT 活性最高，結(jié)締組織活性最弱。 過氧化物酶存在于牛奶、淚液、唾液中，能抑制某些細菌生長和產(chǎn)酸，在過氧化氫存在的條件下，能催化硫氰酸鹽離子(SCN ) 發(fā)生氧化反應(yīng)，中間產(chǎn)物均是強氧化劑，進入菌體后，阻斷已糖激酶、6 磷酸葡萄糖脫氫酶等代謝通路，從而抑制細菌增。 (5)考馬斯亮藍試劑：考馬斯亮藍 G250 100mg 溶于 50ml 95%乙醇，加入100ml 85%濃 H3PO4100ml，最后用蒸餾水稀釋至 1000ml。(1) 渦蟲的切割方式：渦蟲在切割前停止喂食 7d。在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)（0100μg/mL）,蛋白質(zhì)— 色素結(jié)合物在 595nm 波長下的光吸收與蛋白質(zhì)含量成正比。先求出 3 支測定管各自每分鐘 A240降低值，按公式 22 計算CAT 活性。試管編號 1 2 3 4 5 6BSA 濃度（μg/mL）0 20 40 60 80 100OD595值 0 表 31 標準曲線測得值由表 31，用 excel2022 處理，得標準曲線，如圖 31 所示。902177。761177。最適 SDS 濃度為 。未切的渦蟲對各濃度的 SDS 反應(yīng)較小，變化不是很大，但是已切的渦蟲處理一天后 CAT 活力變化劇烈，比活相差很大。177。1.945177。當?shù)竭_ ，酶活性劇烈增加，然后活性開始降低，3mg/l 表現(xiàn)出負影響。綜合整個再生過程中，SOD 的最適 SDS 濃度為 。SOD 酶活的提高要早于 CAT 酶活的提高，這點并不奇怪，因為SOD 酶催化如下反應(yīng)： + 2H+ → H 2O2 + O2 CAT酶催化如下反應(yīng)： 2H2O2 → 2H 2O + O2 超氧化物陰離子自由基（O ）是生物體內(nèi)生成的第一個氧自由基 [35]，因而 SOD酶活會較早出現(xiàn)上升，而生物體內(nèi) H2O2重要來源便是上述 SOD酶所催化的超氧化物陰離子自由基的歧化反應(yīng)，因此，渦蟲體內(nèi) H2O2的積累要晚于 的積累，與此相應(yīng)，CAT 酶活的提高會晚于 SOD 酶活的提高。(5) CAT 與 SOD在不同濃度 SDS脅迫渦蟲再生過程中，體現(xiàn)出協(xié)同性。綜合整個再生過程中，SOD 的最適 SDS濃度為 。渦蟲再生初期即 1~4 天，主要是細胞分裂和分化，耗氧量大增，氧損傷程度增加，活性氧含量升高，從而促進了抗氧化酶—0510152025300 2 4 6 8 10 12再 生 天 數(shù) （ d）SOD比活（U/mg) 0mg/1mg/l2mg/l3mg/lSOD 酶活升高，再生后期細胞分裂分化程度降低，氧損傷減小，SOD 酶活降低， 再生完成恢復(fù)到正常水平。可見，隨著再生天數(shù)的增加，SOD 對 SDS 的耐受濃度降低，最適這體現(xiàn)出 SDS 對 SOD 毒性有積累作用。圖 34 再生不同天數(shù) SOD 酶活隨 SDS 濃度變化趨勢 0510152025300 1 2 3 SDS濃 度 (mg/l）SOD酶活（U/mg) 未 切 2天再 生 1天再 生 4天再 生 7天再 生 10天用 軟件進行統(tǒng)計分析，以 SDS 濃度為自變量， SOD 比活為因變量。95177。177。由圖 33 可以看出，在 SDS 處理下，CAT 酶活隨天數(shù)增加呈先上升后下降，再上升再向下的趨勢，與對照組趨勢相同。結(jié)果表明：012340 1 2 3 SDS濃 度 （ mg/l）CAT比活（U/mg) 未 切 2天再 生 1天再 生 4天再 生 7天再 生 10天CAT酶活未切2天Tukey HSDSubset for alpha = 濃度 N 1 2 3 43 3 1 3 3 3 3 2 3 0 3 Sig. .441 .070 .146 .101Means for groups in homogeneous subsets are displayed.CAT酶活未切2天Tukey HSDSubset for alpha = 濃度 N 1 2 33 3 1 3 3 3 3 2 3 0 3 Sig. .049 .013 .045Means for groups in homogeneous subsets are displayed.表33 未切 2天的各組顯著性差異（其余各組見附件）如表33 所示，未切的培養(yǎng)兩天的渦蟲,3mg/l的與0mg/l、2mg/l極顯著性差異，1mg/l 與0mg/l有極顯著性差異，、SDS相比對CAT酶活性沒有顯著性差異影響。0.0529177。0.1022177。酶活力計算公式：SOD 酶活性（U/ml ）=（）100 ％/（50％ 提取液體積） （公式 25）SOD 酶比活（U/mg）= SOD 酶活性/總蛋白含量（公式 26） 數(shù)據(jù)處理方法統(tǒng)計學處理 計量資料以mean表示，.。 實驗方法(1)取 10ml 具塞試管，加 1ml 酶提取液于沸水浴中加熱煮死，冷卻備用。因此測定生物體內(nèi)可溶性蛋白含量是研究酶活的一個重要項目。喂食時，先將一葉苔拔至燒杯一側(cè)，吸管吸蛋黃液，將吸管輕輕伸至杯底，用手指慢慢擠滿管頭，滴管在杯底一小范圍內(nèi)來回移動，使蛋黃液均勻鋪在杯底，以防止四處擴散。(2)50mmol/L， 的 TrisHCl ：稱取 Tris ，EDTA2Na ，用雙蒸水溶解至 80mL 左右，用 HCl 調(diào)節(jié) pH = 用 pH 計校正，最后定容至100mL。在諸多的測定方法中，以紫外吸收法最為簡便，但樣品中應(yīng)無在 240nm 處有強吸收峰的物質(zhì)；而極譜法等因受實驗設(shè)備儀器條件的限制 [37~38]。本試驗采用