【正文】 化的過程中，需要監(jiān)測以下幾個參數(shù)：總的樣品體積，樣品中總的蛋白，目標蛋白的活性單位，通過這些基本的信息，就可以跟蹤每步純化的效率，計算出目標蛋白的回收率，目標蛋白的比活性，以及純化的倍數(shù)，從而對純化的每一步，乃至整個流程進行定量評價。膜蛋白具有暴露的疏水區(qū)，表達時易于聚集形成包涵體，也有可能由于降解或?qū)毎亩拘宰饔檬沟帽磉_水平極低（45）。圖2：在各種變性劑濃度條件下蛋白質(zhì)的溶解性和構(gòu)象。對蛋白質(zhì)折疊機理的研究，對保留蛋白質(zhì)活性，維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和包涵體蛋白質(zhì)折疊復(fù)性都具有重要的意義(21)。細胞破碎后，通過離心的方法可以很方便的回收包涵體，再用洗滌液（通常含有低濃度的變性劑，表面活性劑，還原劑，EDTA）對包涵體進行清洗，就可以得到較純的包涵體（4，74）。但由于包涵體還含有其它的細胞成分，如膜蛋白、磷脂、核酸，可能影響蛋白質(zhì)的復(fù)性（53,54），為了進一步提高純度，有些研究工作在包涵體變性后先進行蛋白的純化，如親和層析（47,55,57,60,63,64,65, 68）、離子交換層析（47,56）、凝膠過濾層析、反相層析（62），再進行變性蛋白質(zhì)的復(fù)性，層析在變性條件下應(yīng)用為這一策略提供了技術(shù)支持。蔗糖/海藻糖，對蛋白質(zhì)具有優(yōu)先的水合作用/增加黏度折疊進行時的蛋白質(zhì)濃度是體外折疊成功的關(guān)鍵，理想的情況是希望折疊在高濃度的條件下進行，但是在高濃度的條件下變性劑的稀釋常常造成去折疊和部分折疊蛋白質(zhì)的聚集。擴張床吸附技術(shù)可以處理大量的樣品，而且分離的效能不受聚集蛋白質(zhì)的影響，F(xiàn)erre等將蛋白質(zhì)的稀釋折疊和擴張床吸附捕獲技術(shù)相偶聯(lián)，使用STREAMLINETM DEAE陰離子交換介質(zhì)，用于包涵體蛋白質(zhì)HAThβ2m的分離純化，可以得到48%回收率和94%純度的復(fù)性蛋白（23）。Stempfer等在α葡萄糖苷酶的N端或C端加上多聚精氨酸標簽，研究了變性蛋白在肝素親和介質(zhì)上的折疊復(fù)性，通過優(yōu)化實驗條件，蛋白質(zhì)可以在5mg/ml濃度條件下高效復(fù)性(59)。蛋白質(zhì)釋放的方法依賴于蛋白質(zhì)最終在細胞中的定位。由于蛋白質(zhì)大分子具有高的親水性，要求分離介質(zhì)具有親水的界面，為活性大分子提供適宜的微環(huán)境，早期的離子交換介質(zhì)不具有親水的特性和大的孔結(jié)構(gòu)，僅用于小分子的分離純化，Peterson 和 Sober 等在離子交換介質(zhì)的研究上進行了開拓性的工作，選擇特定的纖維素作為離子交換基團的基質(zhì)，合成的離子交換纖維素介質(zhì)具有高的結(jié)合容量和低的不可逆性吸附，并得到實際應(yīng)用（89,90）。蛋白質(zhì)能否獲得高效分離純化既與層析介質(zhì)的理化性質(zhì)（如配基組成、配基密度、孔徑、表面積、顆粒大小、顆粒分散性）有關(guān)，又與流動相參數(shù)（如有機溶劑、pH、金屬離子、解離劑、氧化/還原劑、溫度、緩沖液組成、離子強度、上樣濃度和體積）有關(guān)，正是這些理化參數(shù)的變化使得層析技術(shù)具有更強的通用性，成為最重要的蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)，表3 列出常用層析方法的分離特點和在不同純化階段的應(yīng)用情況（94）。2.4.大多數(shù)情況首選短的多肽標簽，這是因為短的肽標簽對目標蛋白的結(jié)構(gòu)影響最小，在某些應(yīng)用中，短肽不必要去除，因為重組蛋白已經(jīng)具有完全的生物學功能，這也是6 個組氨酸標簽比GST標簽應(yīng)用更廣的原因，而且短肽不具有免疫原性，融合蛋白可直接的用于的制備；而大的親和標簽可能限制重組蛋白的折疊，影響蛋白質(zhì)的生物學功能。甲酸，Asp^Pro，70%甲酸，需要加熱 His標簽融合蛋白可以在非離子型表面活性劑存在的條件下或變性條件下純化，前者在純化疏水性強的蛋白得到應(yīng)用，后者在純化包涵體蛋白時特別有用，用高濃度的變性劑溶解后通過金屬螯和親和層析去除雜蛋白，使復(fù)性不受其它蛋白的干擾，或進行金屬螯和親和層析復(fù)性，前面已作了介紹；3 His標簽融合蛋白也被用于蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)DNA相互作用研究；4 His標簽免疫原性相對較低，可將純化的蛋白直接注射動物進行免疫制備；5 可應(yīng)用于多種表達系統(tǒng)，純化的條件溫和；6 可以和其它的親和標簽一起構(gòu)建雙親和標簽。結(jié)合位點的原子用圓形邊框注釋，sp代表間隔臂，M代表基質(zhì)。 Protein A廣泛的用于純化IgG分子，它是金黃色葡萄球菌的細胞壁成分，可以特異性的結(jié)合免疫球蛋白的Fc區(qū)。 能與抗生物素蛋白特異性結(jié)合的親和標簽后來發(fā)展的8氨基酸Strep tag Ⅱ標簽，與Strep Tag相似，本身并不能生物素化，但卻可以模擬生物素的功能和鏈霉抗生物素蛋白變體StrepTactin特異性的相互作用，可加在蛋白的N端和C端，使用便宜的脫硫生物素進行洗脫，而且Strep tag Ⅱ和StrepTactin相互作用不受變性劑的影響，可在變性條件下純化。一般認為MBP促進可溶性表達與它具有分子伴侶樣的特性有關(guān)，MBP可以直接的和折疊相互作用，抑制聚集的發(fā)生，從而使它區(qū)別于別的標簽（103,109,110）。 鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽（CBP）有26個氨基酸殘基，來源于骨骼肌肌球蛋白輕鏈激酶C末段，鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽與鈣調(diào)素結(jié)合是Ca2+依賴的，這種結(jié)合不受標簽所處的位置影響（N端和C端均可），在中性pH條件下使用2mM EGTA可以很方便的將目標蛋白洗脫下來。S標簽為15 個氨基酸的多肽標簽，可以特異性的和S蛋白介質(zhì)結(jié)合。從我們的論述中，可以看到要得到重組蛋白，可以通過多種途徑，有很多表達純化系統(tǒng)可供選擇，各種系統(tǒng)各有特點和優(yōu)缺點，這時就要綜合考慮。通過對30個哺乳動物全長蛋白和結(jié)構(gòu)域的融合表達研究，Dyson等總結(jié)出了幾個與可溶性表達相關(guān)的蛋白質(zhì)特征，包括蛋白的分子量、毗鄰的疏水氨基酸個數(shù)、低復(fù)雜性區(qū)域，而與蛋白的等電點、疏水性平均值（GRAVY）和亞細胞定位無關(guān)。篩選的M2可以和前面多一個甲硫氨酸的FLAG標簽或C端的FLAG標簽結(jié)合，但這種結(jié)合是Ca2+非依賴的，需要使用低pH洗脫，或用合成的FLAG肽進行競爭性洗脫。 鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽（CBP）基于Protein G的親和標簽最重要的用途在于傳輸?shù)鞍踪|(zhì)藥物，融合蛋白的白蛋白結(jié)合特性使得目標蛋白的血漿半衰期延長，增強了療效。3親和標簽對蛋白質(zhì)包涵體的形成可以促進，也可以減少，不同的標簽有不同的特性，多數(shù)情況還與表達系統(tǒng)相關(guān)。等點聚焦層析是基于蛋白質(zhì)等電點不同的分離模式，以陰離子交換劑為固定相的情況為例，兩性電解質(zhì)緩沖液和離子交換基團相互作用形成pH梯度，蛋白質(zhì)在pH 大于其等電點時吸附，在pH低于其等電點時解吸附，由于蛋白質(zhì)區(qū)帶后部所處微環(huán)境的pH總是低于蛋白質(zhì)區(qū)帶前部所處微環(huán)境的pH，處于后部區(qū)帶的蛋白質(zhì)先于前部開始移動，從而產(chǎn)生聚焦效應(yīng)。擴張床吸附和雙水相萃取整合了細胞碎片處理過程和初步濃縮純化過程，在大規(guī)模純化重組蛋白時具有很強的優(yōu)勢。近年，還有一些其它的方法用于蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性，如雙水相萃取復(fù)性（76,77,78,79），反向膠束復(fù)性（33,75,80），高靜力壓復(fù)性（31,81,82,83），這些方法對特定的蛋白質(zhì)可獲得高的復(fù)性效率，大多還停留在研究階段，相信隨著方法的成熟和普及，將會為包涵體蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性提供更多的選擇手段。A. 凝膠過濾色譜復(fù)性Arora等將這一方法用于人γ干擾素的復(fù)性，產(chǎn)品的得率和比活比文獻報道的都要高（72）。DMSO，調(diào)節(jié)極性 溶解后包涵體蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性這兩個例子都說明折疊機制的復(fù)雜性，也與上面所介紹的理論相吻合。通常從包涵體中回收活性蛋白質(zhì)包括三個步驟：包涵體的分離和洗滌，包涵體蛋白質(zhì)的溶解和溶解蛋白質(zhì)的再折疊。所以如果對于包涵體蛋白質(zhì)，通過機制的研究，能夠解決折疊復(fù)性的問題，那么利用包涵體的高水平表達，就可以得到大量的蛋白質(zhì)，降低生產(chǎn)的成本。包涵體的形成是一個由許多蛋白質(zhì)參與的極端復(fù)雜的動力學過程，依賴于蛋白質(zhì)的折疊速率和聚集速率，并且與蛋白質(zhì)的合成和降解程度相關(guān)（35）。在初始的純化階段，除了使目標蛋白和細胞內(nèi)的DNA、RNA、多糖以及性質(zhì)差別較大的蛋白質(zhì)成分分離，采用的分離方法要能除去影響目標蛋白穩(wěn)定性的雜質(zhì)，保護目標蛋白不被蛋白酶降解，進行目標蛋白的捕獲和濃縮。靈敏的分析方法僅需要少量的樣品，這就給操作帶來了極大的方便。在細胞的提取物中，除了目標蛋白外，還含有其它各種性質(zhì)的蛋白、核酸、多糖等。胞內(nèi)包涵體表達分泌表達至細胞外增強正確二硫鍵的形成，降低蛋白酶對表達蛋白的降解，可獲得確定的N末端，顯著減少雜蛋白水平，簡化純化，不需要細胞破碎在這樣一個混合體系中，蛋白質(zhì)純化要求將目標蛋白與其它的成分分離，得到一定的量，達到一定的純度，同時要盡可能保留蛋白的生物活性，并使蛋白保持完整。在分離純化的每一步，都需要對蛋白和活性進行定量，這就要求分析方法有準確可定量的特點，以對分離純化的效果進行評價。在這一階段的純化中，鹽析沉淀仍然應(yīng)用，但共沉淀的雜質(zhì)常常很多，離子交換層析和疏水層析具有操作上的優(yōu)點，可以再生使用，成為這一步通常選用的層析方法；中間階段純化是最為關(guān)鍵的階段，這時要能達到和大量的雜蛋白分離，利用蛋白質(zhì)不同的性質(zhì)選擇不同的純化方法，每一步的方法要有足夠的選擇性，提高目標蛋白質(zhì)的純度；最后進行精制純化，常用凝膠層析，使目標蛋白的純度進一步提高達到要求。強的表達系統(tǒng)，高的誘導(dǎo)劑濃度，相對較高的培養(yǎng)溫度常常造成包涵體的形成。前兩個步驟效率較高，但是再折疊的效率率常常不能令人滿意，折疊的方法和折疊的條件需要通過實驗來進行篩選。蛋白質(zhì)分子變性后，通過改變折疊的條件使蛋白質(zhì)恢復(fù)其天然構(gòu)象的過程，稱為復(fù)性。兩性離子表面活性劑（Zwitterionic detergents），保護非極性表面 稀釋復(fù)性和透析復(fù)性凝膠過濾復(fù)性時，變性蛋白質(zhì)加樣于折疊緩沖液平衡好的凝膠過濾柱上，然后用折疊緩沖液進行洗脫，凝膠過濾層析有不同的分子量分級范圍，有助于聚集蛋白質(zhì)和正確折疊蛋白質(zhì)的分離。多肽通過在N端或C端加上一個親和標簽，在包涵體的純化上有兩個方面的用途，其一是包涵體變性溶解后，利用親和色譜直接進行包涵體溶液的純化，再用稀釋或透析的方法進行復(fù)性(55,57,60,64,65,68)，其二就是用于親和色譜復(fù)性(61,66,67,69,70)。 層析技術(shù)在分離純化中的應(yīng)用親和層析基于蛋白質(zhì)和親和配體的特異性相互作用，是最為高效的分離純化方法，用于親和層析的配體可以是針對抗原的、針對蛋白質(zhì)分子的受體、酶的底物或抑制劑、針對糖分子的凝集素、活性染料、金屬離子、天然或改造過的相互作用多肽等等。 有的親和標簽可以提高目標蛋白可溶性表達的水平。如麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）具有分子伴侶樣的特性，進行N端融合，常有助于蛋白質(zhì)的正確折疊和活性蛋白的獲得，目的蛋白的MBP融合已成功用于晶體結(jié)構(gòu)的研究（95）。融合蛋白的剪切方法 基于Protein A和Protein G的親和標簽BB融合標簽還可以刺激目的蛋白的抗體響應(yīng)，可用于免疫動物生產(chǎn)。 大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白是malE基因的產(chǎn)物，定位在細胞的周質(zhì)空間，可以特異性的結(jié)合麥芽糖或糊精麥芽糖復(fù)合物，協(xié)助這些物質(zhì)轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)。 纖維素結(jié)合肽（CBD） 幾丁質(zhì)結(jié)合肽這一系統(tǒng)可在多種表達系統(tǒng)中使用，主要的缺點是M1和M2親和介質(zhì)特別昂貴。N端融合硫氧還蛋白和MBP可以最有效的促進蛋白的可溶性表達，C端的融合標簽中MBP最為有效。即使是設(shè)計好了表達純化系統(tǒng)，在實際的應(yīng)用中會遇到新的問題，如選用的表達系統(tǒng)表達水平很低，這種低的表達水平是否在純化上具有優(yōu)勢，GST融合蛋白可能不是可溶性表達而是包涵體，預(yù)先選用的酶切位點存在非特異性酶切，在所用的洗脫條件下蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，這時就要要根據(jù)實際情況來解決問題。所以作者建議如果蛋白具有如下特征：分子量小于30KDa，只含有1或很少數(shù)的低復(fù)雜性區(qū)域，毗鄰疏水氨基酸少于4個，通用的策略是進行N端硫氧還蛋白和MBP融合或C端MBP融合，對于大于50KDa的蛋白，有效的策略是將蛋白質(zhì)切割表達不同的結(jié)構(gòu)域（107）。T7 標簽為T7 基因10蛋白的最前面11個氨基酸，通過免疫親和層析進行純化。與硫氧還蛋白不同，MBP進行C端融合也可以促進蛋白的可溶性表達（107），擴展了MBP的應(yīng)用。這一系統(tǒng)不能進行N端融合，而且變性劑會影響親和相互作用。4 圖6 用于金屬螯和層析的螯和配體。它的主要優(yōu)點如下：1 標簽的分子量小，一般不影響目標蛋白的功能；2羥胺，Asn^Gly，在pH為9條件下，需要加熱，45℃親和標簽對表達水平的影響不僅與親和標簽和目標蛋白相關(guān)，還與可用的表達純化系統(tǒng)密切相關(guān)，需根據(jù)具體情況進行分析。3.親和標簽與目標蛋白之間的作用是相互的，需要綜合的考慮，既要考慮到對目標蛋白結(jié)構(gòu)功能的影響，又要考慮到對標簽與其配體親和作用的影響，以及實際的用途。在層析技術(shù)的發(fā)展過程中，首先是基質(zhì)填料的發(fā)展。重組蛋白在大腸桿菌中得到表達以后，首先必須從細菌釋放才能進行下游的分離純化過程。Zahn等在鎳親和層析柱（NiNTA argrose）上通過鹽酸胍/谷胱甘肽梯度進行帶有組氨酸標簽的人朊病毒蛋白多肽片段的氧化再折疊，抑制了蛋白質(zhì)聚集和分子間二硫鍵的形成，再用咪唑緩沖液對目標蛋白進行洗脫，純化的流程圖如圖4所示(20)。ller等用雙順反子表達載體同時表達等摩爾的A鏈和B鏈，但以包涵體的形式存在，為了得到活性的異源二聚體PDGFAB，包涵體用鹽酸胍變性后，先在變性條件下用凝膠過濾層析進行純化，使用稀釋復(fù)性，蛋白質(zhì)嚴重聚集，即使在10μg/ml蛋白質(zhì)濃度條件下，也只能得到45%可溶性蛋白，而用凝膠過濾復(fù)性，同時洗脫的A亞基和B亞基可以緩慢二聚化產(chǎn)生異源二聚體，,最終異源二聚體得率可達75%（26）。溶解復(fù)性獲得的蛋白質(zhì)，需要通過離心和過濾的方法去除不溶性的物質(zhì)，再按可溶性蛋白質(zhì)的處理方法進行下游的分離