【正文】 優(yōu)化后的儀器設(shè)置條件可儲存以備以后重新設(shè)置和打印。當(dāng) CD45/SSC作圖時，淋巴細(xì)胞可與溶解的紅細(xì)胞、碎片、嗜堿粒細(xì)胞很好地區(qū)分開來。 1．點(diǎn)擊點(diǎn)圖，從 Plot 菜單中選擇 Format dot plot，出現(xiàn)點(diǎn)圖對話框，選擇 No file，點(diǎn)擊 OK。 5． 12． 2 改變 Region 必須首先選擇 Region（在 Region邊界上任何處點(diǎn)擊），然后才能改。在熒光 圖上畫一Region，用該 Region在另一圖（常常是 FSC/SSC）上的位置。 或用括號表示 Not R1 and R2：正確 （所有不在 R1且在 R2 內(nèi)的細(xì)胞） R1 and Not R2：正確 （所有不在 R2且在 R1 內(nèi)的細(xì)胞） R1 Not R2：錯誤 Not （ R1 and R2）：正確 （所有在 R1和 R2 交集以外的細(xì)胞） R1 or R2 and R3：正確 （所有在 R2和 R3交集內(nèi)或在 R1 內(nèi)的細(xì)胞） （ R1 or R2） and R3：正確 （ 所有在 R1或 R2內(nèi)且在在 R3內(nèi)的細(xì)胞 ） R1 or G2 or Not R3 and R4：正確 （ 首先 not R3，然后 and R4，其次或 R1或 R2內(nèi)的細(xì)胞） （ R1 or G2 or Not R3） and R4：正確 （首先括號內(nèi)，然后 and R4） 3．在不同文件之間可拷貝 Region，但無法拷貝 Gate。 R1 or R2（或 R1+R2）： 在 R1內(nèi)或 R2內(nèi)的細(xì)胞都滿足該門的要求 。 5． 12． 4 門 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 24 門由一個或多個 Region組合而成。 5．從 File 菜單選擇 Quit 5． 12 Regions 和 Gating（畫 門） Region是將某一群體細(xì)胞區(qū)分開以分析或分選。 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 22 2． 在 Plot and Stats to Process框中選擇 ALL 在 Pause after each file increment 框中選擇 for seconds，輸入 5 選擇 Print after each file increment 選擇 Export Statistic—new file（選擇或創(chuàng)建目錄及文件名） 選擇 File increment ： 1 3．點(diǎn)擊 OK，從 Batch菜單中選擇 RUN，出現(xiàn) Batch Control框。 5． 11 實(shí)驗(yàn)練習(xí)：數(shù)據(jù)分析 在每管中增加第二、三、四色可增加獲得的信息并降低獲取的管數(shù)。 5．點(diǎn)擊 Acqusition Control窗口 中 Acquire 6．該管獲取完后，會出現(xiàn)“嘟”聲，然后插上下一管（在 Reagent Panel中也為第 二管） 7．重復(fù) 56步，直到 Reagent Panel中最后一管。 3．點(diǎn)擊此對話框的 Select “ ”。 16．移去樣本管，插 上雙蒸水管。 補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)依賴于由同型對照管設(shè)定的探測器電壓。 8．在工具板中選擇象限標(biāo)尺 ,在 FL1/FL2點(diǎn)圖上 以同型對照管的門內(nèi)細(xì)胞畫象限 , 這些象限指定了陰性 /陽性區(qū)域。 1． 在工具板中選擇多邊形的 Region。出現(xiàn) FSC/SSC點(diǎn)圖。 CD3FITC/小鼠 IgG1PE/小鼠 IgG1PerCP/小鼠 IgG1APC。 由于不同激光束在空間位置上的分離而導(dǎo)致一個顆粒在不同的時間產(chǎn)生信號。 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 7 練習(xí)： 3 色或 4色數(shù)據(jù)獲取 在此練習(xí)中，您將： ? 用 FACSComp軟件進(jìn)行儀器質(zhì)控。 廢液 ： 顯示廢液桶是滿或 OK。 補(bǔ) 償： 當(dāng)樣本用 2色或 3色熒光染色時需調(diào)節(jié)補(bǔ)償以消除光譜重疊。 光電倍增管 (PMTs)用于探測 SSC、 FL FL FL3, 因?yàn)樗鼈兪侨跣盘枴? 在用 CellQuest進(jìn)行 3色或 4色分析中，應(yīng)用同型對照和調(diào)補(bǔ)償用對照進(jìn)行儀器條件設(shè) 置。數(shù)據(jù)文件不在實(shí)驗(yàn)文件中保存。 6. 點(diǎn)圖：點(diǎn)擊，可畫點(diǎn)圖，可自定義圖的大小。 CellQuest軟件功能強(qiáng)大且靈活，并與 Macintosh 的多任務(wù)環(huán)境完全兼容。 3. 3 維圖：點(diǎn)擊，可畫 3維圖，可自定義圖的大小。該文件含有從流式細(xì)胞儀獲取的平均 202010000個顆粒數(shù)的數(shù)據(jù)。在優(yōu)化之前需運(yùn)行 FACSComp.。 E02: 將信號放大 100(102)倍。在 DNA分析中，在 FL2上設(shè)閾值。 激光器電流 ： 顯示激光器電流值，當(dāng)高于某值時，在顯示屏上會出現(xiàn)提示信息 樣本電壓： 顯示樣本壓力和鞘液壓力之間的差異。 去選擇 ： 圖框的每個角無黑色方塊。 6. 運(yùn)行 FACSp：依據(jù)圖條下方的提示框內(nèi)的信息進(jìn)行。上述優(yōu)化步驟不僅適用于溶解的 全血細(xì)胞，而且適用于任何感興趣的細(xì)胞。 9. X和 Y軸默認(rèn) FSC、 SSC Multicolor Gating.。所有樣本管都可用來調(diào)節(jié)，一般用同型對照管來調(diào)。如獲 取 3色樣本，跳至第 8步。 選擇適當(dāng)?shù)脑噭┯脕碚{(diào)節(jié)補(bǔ)償很重要。 13．查看 FL3%FL4的補(bǔ)償，應(yīng)為 %,若必要，調(diào)節(jié)該補(bǔ)償。 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 15 8．點(diǎn)擊此對話框的 OK 9．點(diǎn)擊 Acquisition amp。 2．在 Acqusition Control窗口 中不選 Setup。 3．在 Instrument Setting窗口中點(diǎn)擊 Set、 Done。 3．創(chuàng)建一個 FL1H/FL3H點(diǎn)圖（小鼠 IgG1FITC/小鼠 IgG1APC） 4．設(shè)定象限 marker，使得同型對照管門內(nèi)細(xì)胞群在左下象限。 2．從 File 菜單選擇 Open，出現(xiàn)對話框。但要真正刪除 Region，必須從 Gate 菜單中選擇 Region List中刪除。 5． 12． 6 組合門 多個 Region組合而成復(fù)雜的門可以用來分析或分選。 5． 12． 7 在直方圖上使用組合門分析 1．從 Region list 中刪除所有 Region，刪除所有統(tǒng)計(jì)窗口 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 26 2．在 Gate list中選擇 Set All to Default 3． Format所有圖是顯示所有細(xì)胞（即選擇 No Gate） 4．將 FSC/SSC點(diǎn)圖更改為 FL1（ CD3FITC） /SSC 5．在 CD45PerCP/SSC點(diǎn)圖淋巴細(xì)胞上畫 R1 6．在 CD3/SSC點(diǎn)圖 CD3+細(xì)胞上畫 R2 7．從 Gate 菜單中選擇 Gate list，限定 G3=R1 and R2，回車 8．雙擊 G3標(biāo)記，更名為 T lymphocyte，關(guān)閉 Gate list窗口。 5． 12． 5 多色門 1．激活 FSC/SSC點(diǎn)圖，從 Plot菜單上選擇 Format Dot Plot 2．在對話框中選擇 Multicolor Gating，選擇 No gate，點(diǎn)擊 OK， 3． 在另外二個點(diǎn)圖上重復(fù) 2步，點(diǎn)圖上淋巴細(xì)胞呈紅色、單核細(xì)胞呈綠色、粒細(xì)胞呈橘黃色。從 Gate 菜單中選擇 Stop Rotate Region即可停止。 1．選擇目錄和模板 2．從 File 菜單選擇 Get info，所選模板的 info 窗口出現(xiàn)。 8．重復(fù) 23步； 9． X軸參數(shù)： FL1H， Y軸參數(shù)： FL2 –H 10．選擇 G1=R1 11．點(diǎn)擊 Multicolor gating ， OK BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 20 5． 11． 2 限定象限 marker 1．在小鼠 IgG1FITC/小鼠 IgG1PE（同型對照）的 FL1H/FL2H點(diǎn)圖上設(shè)定象限 marker，使得門內(nèi)細(xì)胞群在左下象限。出現(xiàn) Instrument Setting窗口。可編輯 3色或 4色的 Panel。 Storage，出現(xiàn) Acquisition amp。 7．若必要，調(diào)節(jié) FL1%FL2使 PE+細(xì)胞在 FL1/FL2點(diǎn)圖的左上象限。 注意：勿調(diào)節(jié) FL4的 PMT電壓，其電壓值有 FACSComp設(shè)定。 抗體的這種非特異結(jié)合現(xiàn)象是由于抗體的 Fc端與細(xì)胞膜上的 Fc受體結(jié)合。 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 10