【正文】 SYBR Green I法進行檢出時， 要根據融解曲線確認 PCR產物的特異性。 One Step RTPCR只能使用Gene specific Primer， 不適用于 mRNA表達量分析等復數基因的檢出。 但是 ??? 使用 SYBR Green I 進行檢測的問題點 ● SYBR Green I與雙鏈 DNA進行結合后散収熒光，因此如果反 應體系中有非特異性擴增，非特異性 DNA也將同時被檢測， 從而可能導致檢測結果不準確。 Real Time PCR 生物秀 — 專心做生物！ 同一個樣品重復 96次 PCR的擴增曲線 Real Time PCR 原理 Ct值 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR擴增過程中，每個反應管內的熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環(huán)數。 、 LightCycler174。 目的是讓目的基因按照理論值進行擴增，對非特異性反應和引物二聚體要求嚴格。 相對表達量計算 相對值 = 校正值 = 目的基因定量結果 管家基因定量結果 檢測樣品的校正值 對照樣品的校正值 相對定量解析順序 檢測樣品 管家基因 H 目的基因 X 定量結果 定量結果 校正值 相對量 RNA樣品 1 RNA樣品 2 RNA樣品 3 543210123相對表達量（Log2）R N A 樣品1 R N A 樣品2 R N A 樣品3R N A 樣品1R N A 樣品2R N A 樣品3生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR 基礎知識 Real Time PCR 實驗方法 Real Time PCR 解析方法 Real Time PCR 應用實例 Real Time PCR 相關試劑與服務 主要內容 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR 應用實例 定性分析 對人的 ALDH2基因進行 SNP解析 絕對定量 對 SARS病毒培養(yǎng)液中所含 SARS病毒 RNA進行定量分析 相對定量 分析小鼠某目的基因藥物處理不同時間點表達量變化 生物秀 — 專心做生物！ 定性分析應用例 對人的 ALDH2基因進行 SNP解析 檢測方法 Cycling Probe法 SNP位點 ALDH2 type1和 ALDH2 type2 (G/A) 使用試劑 Cycleave PCR Core Kit TaKaRa 使用儀器 Smart Cycler Ⅱ 實驗背景 Aldehyde dehydrogenase2（ ALDH2） 基因位于人類第 12對染色體 q24位置 ， 有 ALDH2 type1和 ALDH2 type2兩種基因型 ， 其基因表現序列最主要的差別在 exon12第 487個氨基酸位置 ，ALDH2 type1型為 Glu(GAA), ALDH2 type2型為 Lys(AAA)。 不易形成引物二聚體。 試劑名稱 SYBR174。 相關系數 斜率 擴增效率（ E）計算方法 標準曲線 X軸表示起始模板濃度（ log10)， Y軸表示 Ct值時 E=101/a1 標準曲線 X軸表示 Ct值， Y軸表示起始模板濃度（ log10) E=10a1 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR 解析方法 ? 標準曲線分析 ? 融解曲線分析 ? 絕對定量和相對定量解析方法 生物秀 — 專心做生物！ Tm值是指雙鏈 DNA分子解鏈一半時的溫度。 目的片段在距 Poly(A) Tail 。 以前對 PCR引物的選擇、 PCR試劑的優(yōu)化 經驗不足， Probe法較為廣用。 ( C代表 Cycle， t代表 threshold） Ct值概念 閾值：在擴增曲線的指數增長區(qū)域內適當位置上 設定的熒光檢出界限。 480 Cepheid公司 Smart Cycler、 Smart Cycler II、 Smart Cycler 174。 Real Time PCR用引物與普通 PCR引物設計要求不同 = 對引物設計要求嚴格 普通 PCR引物 Real Time PCR引物 Real Time PCR引物及探針設計 擴增片段大小 ★ 80150bp(盡量限制在 300bp以內 ) Primer長度 ★ 1725base GC含量 ★ 4060%(最好 4555%) Tm值 ★ ★ ★ 兩條引物的 Tm值盡量接近，引用專用軟件計算 Tm值 序列 ★ 整體上堿基不能過偏 個別部分避免 GC rich或 AT rich(特別是 3’端 ) 避免 T/C連續(xù)， A/G連續(xù) 3’末端序列 ★ 3’末端避免 GC rich或 AT rich 3’末端堿基最好為 G 或 C 3’末端堿基盡量避免為 T 互補性 ★ ★ ★ 引物內部或兩條引物之間避免 3base以上的互補序列 引物 3’末端避免 2base以上的互補序列 特異性 ★ ★ ★ 使用 BLAST檢索，確認引物特異性 RTPCR用引物 ★★ 盡量在 Exon junction上設計引物，限制基因組 DNA擴增 Real Time PCR用引物設計原則 ★ 號表示重要程度， ★ 號越多，表示該參數越重要，設計時要優(yōu)先考慮 生物秀 — 專心做生物！ 目的基因序列獲得 好的引物 需要尋找好的參照序列 引物設計 分析序列 特異性確認 基因組序列確認 RefSeq序列 目的基因 Real Time PCR引物及探針設計 Real Time RTPCR 引物 生物秀 — 專心做生物！ （ 通過 NCBI獲得參考序列和相關情報。 生物秀 — 專心做生物！ 熱變性 酶切 延伸 Cycling Probe法基本原理 退火 RNase H分解 PCR擴增產物 PCR擴增產物 PCR擴增產物 雜合探針 雜合探針 雜合探針 PCR反應 模板 DNA 野生型（ wild homo）為 ROX標記，突變型（ mutant homo）為 FAM標記。 進行 RNA引物設計時通常設計在 exon junction上，使用 genomic DNA的擴增難以進行。 試劑選擇的要素 生物秀 — 專心做生物！ 定量范圍寬廣 擴增效率高， 起峰時間早 低拷貝檢測清晰 反應特異性高， 負對照擴增穩(wěn)定 (無非特異性擴增 ) 間隔距離均勻 信號強度高 試劑選擇的要素 生物秀 — 專心做生物！ 實驗項目 以 λDNA （ 1fg、 10fg、 100fg、 1pg、 10pg、 100pg、 1ng） 為模板，進行 300bp擴增性能及擴增特異性檢測。 擴增效率（ E）： , 越接近 1，越理想。通常 mRNA表達量分析最適。 ◆缺點：需要設計特異性探針，成本高、有時設計困難。 Real Time PCR 原理 生物秀 — 專心做生物！ 在 PCR反應體系中加入熒光物質，并實時監(jiān)測熒光信號積累的整個 PCR進程，最后通過已知濃度的標準品制作的標準曲線對未知濃度的樣品進行定量分析。 TD BioRad公司 iCycler iQ、 iQ5 RealTime PCR Detection System Corbett Research公司 Rotorgene202 Rotorgene3000 、 Rotorgene6000 MJ Research公司 Opticon、 MJ Mini Cycler、 MiniOpticon Stratagene公司 Mx4000174。RefSeq數據庫提供無重復，準確性，完整性的基因參考序列。 利用 Cycleave法的 SNP解析原理 ROX熒光 ROX熒光 FAM熒光 FAM熒光 FAM熒光 ROX熒光 Wild homo hetero Mutant homo SNP point 定性分析應用例 對人的 ALDH2基因進行 SNP解析 Cycling Probe法 PCRRFLP法 ROX FAM ROX、 FAM通道均有信號檢出 Eco57 I CTGAAG(N)16 GACTTC(N)14 wild type :切斷 Mutant type :不切斷 ROX FAM Mutant wild ROX通道有信號檢出 FAM 通道檢出熒光信號 ROX FAM Mutant wild Mutant wild 雜合型 (hetero) 野生型 (wild homo) 突變型 (mutant homo) 生物秀 — 專心做生物！ 提取樣品 引物、探針設計 Real Time PCR反應 數據分析 流 程 定性分析應用例 對人的 ALDH2基因進行 SNP解析 生物秀 — 專心做生物！ 從人血液中（共計 10個樣品）提取基因組 DNA 實驗樣品 提取試劑： Blood Genome DNA Extraction Kit (TaKaRa ) 定性分析應用例 對人的 ALDH2基因進行 SNP解析 生物秀 — 專心做生物！ 實驗結果 定性分析應用例 對人的 ALDH2基因進行 SNP解析 雜合型 突變型 Sample Sample2: 雜合型 (ROX, FAM 同時檢出） Sample6: 突變型（只有 FAM檢出） 其它 Sample: 野生型（只有 ROX檢出） 生物秀 — 專心做生物！ FAM ROX FAM ROX FAM ROX Sample Sample2 同時檢出 ROX、 FAM Sample6只檢出 FAM Sample3 710 只檢出 ROX 雜合型 突變型 野生型 定性分析應用例 對人的 ALDH2基因進行 SNP解析 生物秀 — 專心做生物！ 絕對定量應用例 對 SARS病毒培養(yǎng)液中所含 SARS病毒 RNA進行定量 檢測方法 Taq ManTM probe 法 檢測樣品 3個從 SARS病毒培養(yǎng)液中提取的 genome RNA 目的基因 SARS病毒 RNA 內 參 SARS Internal Control RNA 標 準 品 SARS Control RNA 試 劑 One Step RTPCR Kit（ Perfect Real Time） TaKaRa 儀 器 Smart Cycler Ⅱ 生物秀 — 專心做生物！ SYN247 F02 SYN247R03 SYN247 F01 SYN247R02 SYN247R02 Bam HⅠ Hind Ⅲ pBluescript II SK(+) vector T7 promoter Bam HⅠ Hind Ⅲ SacⅠsite SARS Control RNA構建 絕對定量應用例 對 SARS病毒培養(yǎng)液中所含 SARS病毒 RNA進行定量 生物秀 — 專心做生物！ 絕對定量應用例 對 SARS病毒培養(yǎng)液中所含 SARS病毒 RNA進行定量 純化的 SARS Control RNA OD值測定結果 體外轉錄的 SARS Control RNA 電泳照片 M1 M2 M1: ?Hind Ⅲ digest M2: DL2022 Marker DNase I 處理前 DNase I 處理后