【正文】 id，SCF） ：超過氣液共存時的最高壓力和最高溫度下物質(zhì)特有的點 —— 臨界點后的流體 。 ?特點： 易獲得，強(qiáng)度好；極性基團(tuán)小，形成的反膠團(tuán)空間較大，有利于蛋白質(zhì)等生物大分子進(jìn)入。 ?超濾法在蛋白質(zhì)溶液除鹽、濃縮及分離純化中有廣泛的應(yīng)用。 Column Chromatography 層析柱的制備與層析操作 柱層析的設(shè)備 : 層析柱、蠕動泵（恒流泵）、紫外檢測儀、部分收集器、梯度洗脫器。 ? 吸附劑通過范德華力、靜電引力、疏水作用等與待分離物質(zhì)的極性官能團(tuán)作用。 分配系數(shù) Kd的意義： 1) 可定量地衡量各組分的流出順序。 4. 應(yīng)用 1）脫鹽 ２ ) 生物大分子物質(zhì)的 分離純化 3）分子量的測定 4）溶液濃縮 LogM A B C LogM測 V測 LogM=k1k2Ve （ Ve為洗脫體積） 先測得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的 Ve，并以其分子量對數(shù)對Ve作圖得一直線，再測出待測樣品的Ve，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定分子量。 又稱： 功能層析（ function chromatography） 生物專一吸附（ biospecific adsorption）選擇層析（ selective chromatography） 利用生物大分子間 特異的親和力 來純化生物大分子，如：抗原和抗體；酶和底物或輔酶或抑制劑；激素和受體；RNA和其互補(bǔ)的 DNA等。 “ 接臂 ” 的途徑： 常用二胺化合物（丁二胺、乙二胺、己二胺）。 即：隨著甲醇梯度的增加而洗脫出疏水性越來越強(qiáng)的蛋白質(zhì)。 ② 醋酸纖維素薄膜電泳 ：醫(yī)學(xué)上，常用于分析血清蛋白、胎盤球蛋白，優(yōu)點是簡便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。 T= C= 凝膠濃度越大（?。?，孔徑越小（大），可分離分子量較小（大）的顆粒 。 ? 自由界面電泳： 又稱移動界面電泳 （ moving boundary electrophoresis, MBEP） ，指在沒有支持介質(zhì)的溶液中進(jìn)行的電泳。 用的最多，約占 60～ 70％。 所要分離的目的產(chǎn)物 相應(yīng)的配基 酶 抗體 凝集素 激素 底物、抑制劑、輔酶（輔因子） 抗原、病毒、細(xì)胞 多糖、糖蛋白、細(xì)胞受體 受體、載體蛋白 目的產(chǎn)物與相應(yīng)的配基 4. 偶聯(lián)（親和吸附劑的制備） 配體一定，改造載體（基質(zhì)） 1）基質(zhì)活化： 不同的載體活化需要不同的活化劑。 2） 洗脫： 用降低鹽濃度的平衡緩沖液洗脫。 ? 4）洗脫 ? 洗脫液與平衡時用的 buffer一致。 Sizeexclusion chromatography 凝膠對溶質(zhì)的排阻程度可用分配系數(shù) Kd表示： VeVo Kd=———— Vi Vo—— 外水體積 ，層析柱內(nèi)凝膠顆粒之間空隙的體積（ ml） Vi—— 內(nèi)水體積 ，層析柱內(nèi)凝膠顆粒內(nèi)部各微孔體積的總和（ ml） Ve—— 某組分的洗脫體積 ，從加進(jìn)層析柱到流出液中該組分出現(xiàn)高峰時的洗脫液體積（ ml） 凝膠過濾柱色譜洗脫的三種峰 Ⅰ . Kd=0時 ,即 Ve=Vo,說明該組分分子量足夠大 ， 不進(jìn)入微孔 ， 最先流出 。 蛋白 質(zhì) 定量 —— 分光比色 儀 (A280)法 蛋白質(zhì)分子中的 色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基 （ 主要是 色氨酸 Trp和酪氨酸 Tyr 的 共軛雙鍵 ） 對紫外光有吸收，以 色氨酸 吸收最強(qiáng)，最大吸收峰為 280nm。 凝膠層析 ：利用某些凝膠對于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。 2）透析袋的保存 ： 防腐劑＋冷藏。 功能 溶解非極性物質(zhì) 溶解極性物質(zhì) ? p154 2. 萃取過程 第一步： 將酶從水相中萃取到反膠束相中。 a 雙節(jié)線 系線 b 雙節(jié)線 均相區(qū) 均相區(qū) 兩相區(qū) 兩相區(qū) 系線 臨界點 PEG/Dx和 PEG/KPi系統(tǒng)的典型相圖 ? 幾種典型的雙水相系統(tǒng) ? 聚丙二醇 聚乙二醇、聚乙烯醇 ? 葡聚糖（ Dex） ? 羥丙基葡聚糖 ? 聚乙二醇（ PEG） 葡聚糖（ Dex） ? 硫酸葡聚糖鈉鹽 聚丙烯乙二醇 ? 羧基甲基葡聚糖鈉鹽 甲基纖維素 ? 聚乙二醇（ PEG） 磷酸鉀、 硫酸銨 ? 硫酸鈉、硫酸鎂 2. 萃取原理： 利用生物物質(zhì)在雙水相體系中的選擇性分配。 ? ⑶ 有機(jī)溶劑變性 ? 使那些對有機(jī)溶劑敏感的雜蛋白變性沉淀。 ? 一般可在室溫下進(jìn)行。 調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計算表 鹽析操作 ? 低飽和度： 飽和溶液滴加法。 根據(jù) 顆粒的密度不同 而進(jìn)行分離。 ? 使用冷凍離心機(jī)時提前降溫，預(yù)冷離心頭。 ? 提取目標(biāo)： a. 將 目的酶最大限度地溶解出來。 ?濃縮與干燥 （ concentration and desiccation）（成品加工） :使酶與溶劑分離的過程。 ? 2）表面活性劑處理： 常用非離子型表面 ?活性劑，如 Triton X100， Tween等。 RCF = m r （ 2? N/60） 2 /mg= ?105 N2 r 此公式描述了相對離心力與轉(zhuǎn)速之間的關(guān)系 旋轉(zhuǎn)半徑用 r平均 代替 r平均 =1/2（ r大 +r小 ） cm 通常： ?低速離心以 每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù) 表示，如： 4000r/min。 2）壁效應(yīng)嚴(yán)重。 2) 鹽析 （ salting out） ： 高濃度的中性鹽降低蛋白質(zhì)的溶解度。 Ks代表鹽析效率 ，其含義是隨著鹽濃度的增加，蛋白質(zhì)溶解度降低的速度， Ks越大鹽析效果越好。 2. 沉淀劑： 常用 聚乙二醇 （ Polyethyene glycol，簡寫 PEG ） 多用分子量為 6000～ 20220的 PEG。 ? 在一定溫度、壓力下，溶質(zhì)分布在兩個互不相溶的溶劑里，達(dá)到平衡后，溶質(zhì)在兩相中的濃度比為一常數(shù)。 ?基本過程： ?1）在 SCF中，溶解度大的物質(zhì)溶于其中，與不溶解或溶解度小的物質(zhì)分開。 ? 4）破壁功能，直接從完整細(xì)胞提取酶蛋白。 二、層析法 ? 層析法也稱色譜法，是 1903年俄國植物學(xué)家 Michael Tswett發(fā)現(xiàn)并命名的。 層析操作 ?分離中： 上樣： 體積盡可能小。 羥基磷灰石 （ HA） [Ca10(PO4)6.(OH)2] : 微晶型的磷酸鈣制品， 表面有 Ca2+和 PO43兩種帶電基團(tuán)； 酸性和中性蛋白質(zhì)可與 Ca2+結(jié)合；堿性蛋白質(zhì)可與 PO43結(jié)合。 BioGel A (美國） 依靠糖鏈之間的次級鍵維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，瓊脂糖密度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越密集。 pI 蛋白 質(zhì)帶 正 電 pI 蛋白 質(zhì)帶負(fù)電 2. 陰離子交換劑分離蛋白質(zhì) 的 過程 平衡 吸附 去吸附 分離結(jié)束 再生 + 低鹽 高鹽 利用不同 鹽濃度將 不同蛋白 質(zhì) 洗 脫下 來 Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Ionexchange chromatography 3. 操作 平衡 上樣 平衡 洗脫 再生 1）上樣： 上樣體積不十分嚴(yán)格。 ④ 適當(dāng)?shù)亩嗫仔浴? ②溶劑系統(tǒng)采用高壓，因此洗脫速度增大。 2）電場強(qiáng)度： E越高， v越快。分辨率較高。 3. 電泳常用設(shè)備 （ 1）電泳儀 ： 為電泳提供穩(wěn)定直流電源的裝置 。（用 buffer保持恒定） ? 離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度越高， v 越低。 顆粒大小對分辨率的影響 流速為 240ml/hr 流速對分辨率的影響 顆粒大小為 50－ 80目。 可被應(yīng)用的基質(zhì)（載體） ： （按性能優(yōu)劣排序） 瓊脂糖凝膠、聚丙稀酰胺凝膠、葡聚糖凝膠、纖維素。 制備純化生物大分子 圖 439 梯度溶液的制備方法和洗脫曲線 （ a）線性梯度；（ b）凸形梯度；（ c）凹形梯度；（ d）編程梯度 （四）疏水層析 （ Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC） 從分離純化的機(jī)制看，屬吸附層析類。 以丙烯酰胺為單體，以甲叉雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑聚合成的高分子聚合物。 3. 洗脫劑 要求： 粘度小，純度高， 穩(wěn)定性好，完全洗脫下所要分離的成分 ,易與目標(biāo)分子分離。 洗脫： 連續(xù)梯度洗脫：連續(xù)改變緩沖液的 pH或離子強(qiáng)度。 ? 色譜起源 色譜 組分 色素 石油醚 碳酸鈣顆粒 用色彩（ chroma）和圖譜（ graphs）組成色譜一詞（ Chromatography) 。 第二節(jié) 酶的精制 酶純化的基本原則： ①建立一個方便靈敏的分析方法； ②選擇有效的純化方法，盡可能減少純化步驟； ③常在低溫（ 4℃ ）條件下進(jìn)行純化，以避免酶的變性。 ?常用超臨界液態(tài) CO2作為萃取劑， ? 因為： ?1）液體 CO2無毒 ?2）臨界溫度（ ）接近常溫 ?3）臨界壓力（ ）較低 ?4）操作安全 ?超臨界 CO2萃取技術(shù)在生物、食品 ?等工業(yè)中的應(yīng)用 ? CO2萃取部分產(chǎn)品 ? 原料名稱 產(chǎn)物名稱 原料名稱 產(chǎn)物名稱 ? 小麥胚芽 胚芽油 豆子 豆油精煉油 ? 啤酒花 啤酒花精油 茉莉花 凈油 ? 辣椒 辣椒紅色素 菊花根 除蟲菊酯 ? 當(dāng)歸 精油 紫草 紫草寧 ? 銀杏葉 銀杏內(nèi)酯 花生 精煉油 （四） 反膠團(tuán)萃取 ? 1. 反膠團(tuán)： 又稱反膠束（ Reversed Micelles） ? 指 表面活性劑 （ 由親水的極性基團(tuán)和疏水的非極性基團(tuán)兩部分組成）分散在連續(xù) 有機(jī) 溶劑 中自發(fā)形成的一種穩(wěn)定的納米級的聚集體 。 ? 普通有機(jī)溶劑萃取難以進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離， ? 因為 : ?1） 蛋白質(zhì)親水性，不溶于有機(jī)溶劑 ?2） 蛋白質(zhì)在有機(jī)相中易變性失活 故溶劑萃取法一般僅用于抗生素等小分子生物物質(zhì)的提取 。 ?② 沉淀效能高 ， 使用少量的 PEG即可沉淀相當(dāng) ? 多的生物大分子 。 β 分級鹽析法 ： 在一定離子強(qiáng)度下，通過改變?nèi)芤旱?pH及溫度的沉淀方法 。 不同蛋白質(zhì)分子量、表面電荷不同，在不同鹽濃度下沉淀， 逐漸增大鹽濃度，不同蛋白質(zhì)先后析出，稱分段鹽析。 差速離心分離示意圖 （ a）離心前的懸浮液 （ b）～（ e）離心不同時間后顆粒的沉降情況 2．密度梯度離心 （ density gradient centrifugation） 樣品在 密度梯度介質(zhì) 中進(jìn)行離心，使沉降系數(shù)比較接近的組分得以分離的一種