【正文】 和酶，可適當提高溫度，使雜蛋白變性分離且也有利于提取和進一步純化。 一、鹽析沉淀法 『 鹽溶 』 是加鹽使蛋白質(zhì)融入水中， 『 鹽析 』 是加鹽使蛋白質(zhì)沉淀出來。 等電點時，分子表面的水膜仍然存在，使酶和蛋白質(zhì)仍有一定的溶解度而沉淀不完全。 二、離心方法的選用 差速離心 采用不同離心速度與時間，使不同沉降速度的顆粒分批分離； 已破碎的細胞 沉淀（細胞核） 上清液 沉淀（細胞膜碎片、線粒體、溶酶體） 上清液 沉淀（核糖核蛋白體） 上清液（可溶性組分） 500g,10’ 10 000g,10’ 100 000g,3h 密度梯度離心 又稱 速率 — 區(qū)帶離心 ,沉降系數(shù)較接近的物質(zhì)分離的方法； 原理 ：不同顆粒之間存在沉降系數(shù)差時，在一定離心力 作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區(qū) 域上形成區(qū)帶的方法。 決定于沉降速度和沉降距離。 （ 1）微濾 截留的物質(zhì)顆粒直徑為～ 2um， 操作壓力 以下。 （ 1）電滲析 樣品液 緩沖液 如圖 離子交換膜代替一般膜 主要指透析；利用小分子擴散作用透過半透膜，而大分子被截留；用于酶、蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的分離。 粗濾 微濾 ? 微孔過濾 ,截留顆粒直徑 ～ 2μ m，光學顯微鏡可見顆粒，采用微孔陶瓷、微濾膜等。 對密度梯度 ,指形成界限分明區(qū)帶的時間， 區(qū)帶形成時間 。 ?分制備用、分析用、制備及分析用三種。 ? 蛋白質(zhì)用鹽析方法沉淀分離后，還需要脫鹽才能進一步精提純。 是酶分離純化常用的方法之一。一些和脂結(jié)合較牢或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)，不溶于水、稀鹽或稀堿液中，可用不同比例的有機溶劑提取。 自溶溫度選在 0～ 4℃ ，因自溶時間較長，不易控制，所以制備活性蛋白質(zhì)時較少用。對膜結(jié)合酶的提取特別有效。 頻率 10~20KHz， 功率 100~150W， 溫度0~10oC， pH4~7， 時間 3~10min， 間隔多次 。 酶分離純化的一般原則 : 第一節(jié) 細胞破碎 （ link)第二節(jié) 酶的提取 (link) 第三節(jié) 沉淀分離 (link) 第四節(jié) 離心分離 第五節(jié) 過濾與膜分離 第六節(jié) 層析分離 第七節(jié) 電泳分離 第八節(jié)萃取分離 第九節(jié) 酶的結(jié)晶 第十節(jié) 濃縮與干燥 本章主要內(nèi)容 : go 第一節(jié) 細胞破碎 ?一般動物組織和細胞可用電動搗碎機或勻漿器破碎或用超聲波處理破碎。 二、物理破碎法 通過溫度、壓力、聲波等各種物理因素的作用使組織細胞破碎 溫度差破碎法 冷凍 高溫，用于脆弱易破菌，難以工業(yè)化 。 有機溶液 粉碎后的新鮮材料在 0℃ 以下加入 5～ 10倍量的丙酮，迅速攪拌均勻，可破碎細胞膜，破壞蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的結(jié)合。 革蘭氏陰性菌：除了 溶菌酶外，另加 EDTA才有效。如6磷酸葡萄糖脫氫酶用 。 蛋白質(zhì)（酶）的分離純化 ? 蛋白質(zhì)分離純化的方法很多，主要是根據(jù)蛋白分子之間特異性的差異，如分子大小，溶解度，電荷等建立起來的。 I=1/2∑m iZi2 酶在溶液中的溶解度與溶液中的離子強度的關(guān)系式： 蛋白質(zhì)和酶在溶液中的溶解度與溶液中的離子強度有密切的關(guān)系 β =LogSo ： 取決于酶的性質(zhì)，也與溫度和 pH有關(guān)。介電常數(shù)通常隨溫度和介質(zhì)中傳播的電磁波的頻率而變。 操作：介質(zhì)溶液與樣品液混合均勻，足夠時間離心。 以膜為過濾介質(zhì)的過濾稱 膜分離 技術(shù)； 微濾、超濾、反滲透、透析、電滲析都屬于膜分離技術(shù) 表 44 過濾的分類與特性（ P112） 類別 截留的顆粒大小 主要物質(zhì) 過濾介質(zhì) 粗濾 2um 酵母、霉菌、動植物細 胞、固形物 濾紙、濾布、纖 維、多孔陶瓷 微濾 ~2um 細菌、灰塵 微濾膜 超濾 20A~ 病毒、生物大分子 超濾膜 反滲透 20A 生物小分子、 鹽、離子 反滲透膜 一、非膜過濾 截留顆粒直徑大于 2μ m,用于分離酵母、霉菌、動植物細胞、培養(yǎng)基殘渣等。 在發(fā)酵行業(yè)中，由于傳統(tǒng)分離工藝技術(shù)條件的限制，預(yù)處理中常有 515%的產(chǎn)品損失，大量的可溶性蛋白、大分子雜質(zhì)被帶入到下游工序，增加了后提取工藝的環(huán)節(jié)和負荷，影響產(chǎn)品質(zhì)量及生產(chǎn)收率。 (3)反滲透 反滲透（ RO）是膜分離技術(shù)的一個重要組成部分 膜孔徑小于 20 197。 (1)常壓過濾 以液位差為推動