《酶的分離純化》ppt課件-文庫吧
2025-12-07 20:18 本頁面
【正文】 Triton(辛基酚聚氧乙烯醚 ,聚乙二醇辛基苯基醚 )。 Tween(聚氧乙烯山梨醇酐 單棕櫚酸 酯 ,吐溫 ,聚氧乙烯山梨醇酐三硬脂酸 酯 ) 用凝膠層析等方法除去表面活性劑，以便酶的進一步純化。對膜結合酶的提取特別有效。 表面活性劑 Back 四、酶學破碎法 在一定條件下，通過外加的酶或細胞本身存在的酶的作用，使細胞破碎。 簡單原理 :溶菌酶處理時，它能水解構成枯草菌等菌體膜的多糖類。能溶解菌的酶分布很廣。尤其卵白中含量高，而多易結晶化。 外加酶 1g菌體加 1～ 10mg溶菌酶， ～ 。于生理食鹽水或 ，雖失去細胞膜，但原形質(zhì)沒有脫出。 蝸牛酶及纖維素酶 也常被選為破壞細菌及植物細胞用。 革蘭氏陽性菌：細胞結構和形狀依賴于壁上的肽多糖， 溶菌酶 能專一性作用于肽多糖的 β 1， 4糖苷鍵。 革蘭氏陰性菌：除了 溶菌酶外，另加 EDTA才有效。 酵母：其細胞壁的主要成分是 β 1， 3葡聚糖，需加 β 葡聚糖酶 ； 霉菌：其細胞壁含有幾丁質(zhì)，可用 幾丁質(zhì)酶 ； 植物細胞：纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶。 將待破碎的鮮材料在一定 pH和適當?shù)臏囟认拢米陨淼牡鞍酌笇⒓毎茐?，使細胞?nèi)含物釋放出來。 自體融解時需要時間，需加少量甲苯、氯仿等。應防止細菌污染。于溫室 30℃ 左右較早溶化。 自體融解過程中 PH顯著變化，隨時要調(diào)節(jié) pH。 自溶溫度選在 0～ 4℃ ，因自溶時間較長，不易控制，所以制備活性蛋白質(zhì)時較少用。 適宜的自溶條件：溫度、 pH值、離子強度等 加入噬菌體感染細胞 電離輻謝 自溶法 Back 第二節(jié) 酶的提取 ?是指在一定條件下，用適當?shù)娜軇┨幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑中的過程。也稱酶的抽提。 ?目的 : 讓制備物充分溶解，并盡可能保持原來的天然狀態(tài)，避免因長久放置造成制備物的分解破壞 ?大部分蛋白質(zhì)均溶于水、稀鹽、稀堿或稀酸溶液中。因此蛋白質(zhì)的提取一般以水為主。 ?稀鹽溶液和緩沖溶液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶度大，也是提取蛋白質(zhì)的最常用溶劑。 鹽溶現(xiàn)象 : 在一定濃度的鹽存在下 ,酶的溶解度增加 . 鹽析現(xiàn)象 : 當鹽的濃度太高 ,蛋白的濃度反而下降 ,從溶液中析出 .一般采用稀鹽溶液， ~。 等滲鹽溶液尤以 ～ 鹽緩沖液常用。 。如6磷酸葡萄糖脫氫酶用 。 一、酶提取的主要方法 鹽溶液提取 蛋白質(zhì)提取液的 pH值首先應保證在蛋白質(zhì)穩(wěn)定的范圍內(nèi)，即選擇在偏離等電點兩側。 如堿性蛋白質(zhì)則選在偏酸一側，酸性蛋白質(zhì)選擇偏堿一側，以增大蛋白質(zhì)的溶解度，提高提取效果。 酸性條件下溶解度較大，且穩(wěn)定性較好，宜用酸溶液提取。 酸溶液提取、堿溶液提取 原則： 如細胞色素 C屬堿性蛋白質(zhì)，常用稀酸提?。? 肌肉甘油醛 3磷酸脫氫酶屬酸性蛋白質(zhì)，用稀堿提取； 某些蛋白質(zhì)或酶與其分物質(zhì)結合常以離子鍵形式存在，選擇 pH3～ 6范圍對于分離提取是有利的。 與脂質(zhì)結合比較牢固或分子中含非極性基團較多的酶需用有機溶劑提取。 有機溶劑提取用于提取蛋白質(zhì)的實例至今是不多的。一些和脂結合較牢或分子中非極性側鏈較多的蛋白質(zhì)，不溶于水、稀鹽或稀堿液中，可用不同比例的有機溶劑提取。 例 : 從一些粒線體（ Mitochondria)及微粒體（ Microsome)等含多量脂質(zhì)物質(zhì)中提取蛋白質(zhì)時，采用 Morton的丁醇法效果較好。 因丁醇使蛋白質(zhì)的變性較少，親脂性強，易透入細胞內(nèi)部，與水也能溶解 10%，因此具有脂質(zhì)與水之間的表面活性作用，可占據(jù)蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的結合點，也阻礙蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的再結合，使蛋白質(zhì)在水中溶解能力大大增加。 有機溶劑提取 二、影響酶提取的主要因素 溫度 為了防止酶變性失活，溫度不宜高； 多數(shù)酶的提取溫度在 5℃ 以下； 耐溫較高的酶可適當提高溫度，以提高酶溶解度和擴散速率。 少數(shù)對溫度耐受性較高的蛋白質(zhì)和酶，可適當提高溫度，使雜蛋白變性分離且也有利于提取和進一步純化。 如胃蛋白酶等及許多多肽激素類，選擇 37～ 50℃ 條件下提取，效果比低溫提取更好。 pH值 為了防止酶的變性， pH不宜過高或過低；溶液的pH值應遠離酶的等電點，以增加酶的溶解度。 提取液的體積 提取液的用量增加，可提高提取率； 過量，酶濃度降低，不利進一步純化。 ? 從細胞中提取得到的生物大分子往往是不純凈的，含有大量雜質(zhì)，必須進一步分離純化，這一階段可分為 粗分級分離和細分級分離 兩步進行。 蛋白質(zhì)（酶）的分離純化 ? 蛋白質(zhì)分離純化的方法很多，主要是根據(jù)蛋白分子之
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