【正文】 型 嚴緊性和 松弛型 在基因工程中使用的質(zhì)粒都是松弛型質(zhì)粒 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 二、質(zhì)粒（ plasmid）載體的構(gòu)建 理想質(zhì)粒載體所具備的條件 ? 質(zhì)粒較小 ? 質(zhì)粒帶有可供選擇的標(biāo)記 ? 帶有盡可能多的單一限制酶切位點 ? 應(yīng)有較高的基因表達能力 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 二、質(zhì)粒（ plasmid）載體的構(gòu)建 質(zhì)粒人工構(gòu)建的目的 ? 天然質(zhì)粒往往存在著這樣或那樣的缺陷，因而不適合用作基因工程的載體必須對之進行改造構(gòu)建： （ 1） 加入合適的選擇標(biāo)記基因 ，如兩個以上，易于用作選擇 （ 2） 增加或減少合適的酶切位點 ，便于重組 （ 3） 縮短長度 ，切去不必要的片段，提高導(dǎo)入效率， 增加裝載量 （ 4） 改變復(fù)制子，變嚴緊為松弛，變少拷貝為多拷貝 （ 5）根據(jù)基因工程的特殊要求 加裝特殊的基因元件 方法就是重組，拼拼接接，挖肉補瘡。這兩個部分可獨立存在， 分別由兩個基因編碼。 * 這種指示也可以是 選擇性 的（如 TcS），也可以是 非選擇性 的（如 TcS， lacZα, GUS ），絕大多數(shù)為后者。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 2) 氨芐青霉素抗性基因 （ Apr） Ampicillin可抑制細菌細胞膜上參與細胞壁合成酶類的活性。 8） 發(fā)光蛋白質(zhì)基因 發(fā)光蛋白是由水母產(chǎn)生的一種可發(fā)光的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可使大腸桿菌菌落呈藍色。 三、其他質(zhì)粒載體 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 二、 釀酒酵母 (Saccharomycea cerevisiae)的分子克隆載體 1) 按復(fù)制方式劃分 i. 自主復(fù)制型； ii. 整合型（非自主復(fù)制型） Yeast Integration plasmid(YIp) 2)按復(fù)制子來源劃分 i. 附加體型 yeast episomal plasmid(YEp)，其復(fù)制起點來自于釀酒酵母的天然質(zhì)粒 2μ質(zhì)粒 ii. 染色體復(fù)制型 Yeast Replicating plasmid(YRp)，其復(fù)制起點來自染色體上的自主復(fù)制序列 (ARSautonomous replicating sequence) 三、其他質(zhì)粒載體 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 4. pYAC載體 酵母菌人工染色體 (yeast artificial chromosome, YAC)廣泛用于構(gòu)建高等動植物基因組文庫的構(gòu)建 , 由 YLp經(jīng)適當(dāng)改造后構(gòu)建成 pYAC載體。進入細胞后，通過質(zhì)粒上的復(fù)制子進行復(fù)制。由于動物細胞的培養(yǎng)和操作較復(fù)雜、花費也較多，因而 病毒載體構(gòu)建時一般都把細菌質(zhì)粒復(fù)制起始序列放置其中。因復(fù)制起點與該基因的啟動子順序相近，故它本身的表達也受到 T抗原的控制。 這樣一來 ， 為分別分離外源ＤＮＡ分子的兩條鏈帶來一定的麻煩 ， 解決這一問題的一個行之有效的方法就是定向克隆技術(shù) 。 ? 質(zhì)粒復(fù)制子包括：一個復(fù)制起點和兩個抗性基因Apr 、 Tcr。篩選啟動基因、終止子等。 β —半乳糖苷酶基因的優(yōu)點 : a. 酶催化 XGal水解為蘭色產(chǎn)物，檢測直觀 b. lacZα 編碼 539。有的基因是不能用作選擇性標(biāo)記基因（ lacZ， GUS等）。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 2. 標(biāo)記基因的種類 1） 抗性標(biāo)記基因 （可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子） a. 抗生素抗性基因 : Apr ， Tcr ， Cmr， Kanr， G418r，Hygr ， Neor b. 重金屬抗性基因 : Cur ， Znr ， Cd r c. 代謝抗性基因 : TK，抗除草劑基因 2） 營養(yǎng)標(biāo)記基因 （可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子） 主要是參與氨基酸，核苷酸及其他必需營養(yǎng)物合成酶類的基因， 這類基因在酵母轉(zhuǎn)化中使用最頻繁，如 TRP1，URA3， LEU2， HIS4等。端可容許很大的變化而不影響酶活性 c. lacZα 和 β 鏈基因的分別表達可使載體小而容量大 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 6） 葡萄糖苷酸酶基因（ GUS） 該基因編碼一種可分解各種 β 葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。 人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能及用途分為： 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 二、質(zhì)粒（ plasmid）載體的構(gòu)建 人工組建克隆載體 pBR322 ? 大?。? kb ? 選擇標(biāo)記： Apr Tcr ? 單一酶切位點： EcoRⅠ HindⅢ BamHⅠ PstⅠ I SalⅠ 等 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 二、質(zhì)粒（ plasmid）載體的構(gòu)建 人工組建克隆載體 pBR322 ? 用于組建 pBR322的 三個親本質(zhì)粒 的特征： ? pSE2124： Apr基因 ? pMB8 :Col EI松弛型復(fù)制子 ? pSC101:Tcr基因 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 二、質(zhì)粒（ plasmid）載體的構(gòu)建 人工組建克隆載體 pUC系列質(zhì)粒 ? 多拷貝大腸桿菌型質(zhì)粒，包括 pUC8/9 pUC18/19 ? pUC的親本質(zhì)粒是 pBR322,包括如下四個部分： ? 來自 pBR322 的復(fù)制起點（ ori） ? 來自 pBR322的 Apr基因（核甘酸序列已發(fā)生改變） ? lacZ基因及其啟動子組成 lacZ‘ 基因 ? lacZ‘ 內(nèi)部人工組裝了一個多克隆位點（ MCS） 它含有如下單一酶切口： EcoRI、 SstI、 KpnI、 SmaI、BamHI、 XbalI、 PstI、 SphI、 HindIII。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 Cosmid載體的特點