【正文】 取 A液 16ml與 B 液 1ml稀釋 1 倍即成 。 7 參考書 （ 1）天津輕工業(yè)學(xué)院等，《工業(yè)發(fā)酵分析 》，輕工業(yè)出版社， 1980 年 實驗四 蛋白酶活力的測定方法 1 原理 根據(jù)福林試劑 (磷鉬酸與磷鎢酸混合物 )，在堿性情況下極不穩(wěn)定，可被酞類化合物還原而呈藍(lán)色反應(yīng) (鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物 )，由于蛋白質(zhì)分子中含有酚基的氨基酸 (如酪氨酸、色氨酸及苯丙氦酸等 )，它使蛋白質(zhì)或其水解產(chǎn)物也呈這個反應(yīng)，于是就可利用這個原理來測定蛋白酶活力的強(qiáng)弱，即以酪蛋白為作用底物，在一定 pH與溫度下，同酶液反應(yīng)，經(jīng)一定時間后，加入三氯醋酸，以終止酶反應(yīng)，并使殘余的酪蛋白質(zhì)沉淀，同水解產(chǎn)物分開，經(jīng)過濾后取 濾液 (即含蛋白水解產(chǎn)物的三氯醋酸液 )。另外，斐林試劑中加入亞鐵氰化鉀 (黃血鹽 )，使紅色氧化亞銅沉淀生成可溶性的復(fù)鹽，反應(yīng)終點更為明顯。 20％鹽酸溶液 量取 20 毫升濃鹽酸，緩慢倒入 80 毫開水中。試樣的水分一般是指在 100℃左右直接干燥的情況下，所失去的總量。 ZY ZYR D F ?????? 0051 1)(100 ?????????????? (8) 式中： RDF —— 啤酒的真正發(fā)酵度， % ； Y —— 啤酒的原麥汁濃度， 176。 a) 試樣的制備：將重量法 (在已知重量的蒸餾燒瓶中 )蒸餾除去酒精后的殘液，冷卻至20℃，準(zhǔn)確補(bǔ)加水使殘液至 ，混勻。 試樣餾出液 (20℃ )的相對密度按式 (4)計算： mm mmd ??? 122020 ???????????????????????? (4) 式中： d2020 —— 試樣餾 出液 (20℃ )的相對密度 (比重 )； m2 —— 密度瓶和餾出液的質(zhì)量， g ； m —— 密度瓶的質(zhì)量， g ； m1 —— 密度瓶和水的質(zhì)量， g 。 b) 用標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液校正自動電位滴定儀。 4 分析步驟 蒸餾 將雙乙酰蒸餾器安裝好，加熱蒸汽發(fā)生瓶，使水至沸。 查表得 100ml麥芽汁中麥芽糖毫克數(shù) 1000 f179。 （ 3） %淀粉溶液 ，加少量水調(diào)成糊狀，在不斷攪拌下注入 200ml沸水中，微沸 2min，冷卻，加水稀釋成 250ml。 8年來結(jié)構(gòu)調(diào)整仍變化不大， 1999 年糖化酶占總產(chǎn)量比例達(dá)到 64％。 五、我國發(fā)酵工業(yè)的主要進(jìn)步 1，發(fā)酵產(chǎn)品增長快、質(zhì)量明顯提高，在國民經(jīng)濟(jì)中起重要作用 新型發(fā)酵工業(yè)：年產(chǎn)量 115 萬噸；產(chǎn)值 150億；利稅 50億。 2020年酒精產(chǎn)量約為 250萬噸左右。 1981 年在順義縣以 1 萬噸的年產(chǎn)量起步，到 2020年增至 141 萬噸，躍居全國第二。 1949 年新中國成立時，我國白酒的產(chǎn)量只有 萬 t。化學(xué)法工藝有以下缺點：需在高溫條件下反應(yīng)，能源消耗大；高溫導(dǎo)致油脂的降解 ，產(chǎn)生深褐色和焦糊味；需要分子精餾分離單甘酯和二甘酯。 2，二是生物催化合成已成為化學(xué)品合成的支柱之一。這個階段中，工業(yè)上普遍采用分批培養(yǎng)和分批補(bǔ)料培養(yǎng)法。但是，使用 200M3容積的發(fā)酵器，使得在接種物的擴(kuò)大和保持無雜菌狀態(tài)都帶來困難。在 18世紀(jì)末到 19世紀(jì)初，基礎(chǔ)培養(yǎng)基是用巴氏滅菌法處理，然后接種 10%優(yōu)質(zhì)醋使呈酸性，可防治染菌污染。 Protein engineering) （ 3）基因工程 (Geic engineering) （ 4）細(xì)胞工程 (Cell engineering)2，是生物工程中其他技術(shù)產(chǎn)業(yè)化表達(dá)的重要手段 基因工程菌 動植物細(xì)胞培養(yǎng) 3，生命科學(xué)研究的對象或載體 第四節(jié) 發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展史 一、國外發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展概況 發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展史，可以劃分成五個階段。由于次級代謝產(chǎn)物在工業(yè)上的重要性，促使人們對微生物的注意力超過了它們的產(chǎn)物。 微生物的 初級代謝產(chǎn)物及其在工業(yè)上的用途 初級代謝產(chǎn)物 用 途 乙醇 檸檬酸 丙酮和丁醇 谷氨酸 賴氨酸 核苷酸 含酒精飲料中的活性成份 與石油混合后，可作為汽車的燃料 食品工業(yè)與化學(xué)工業(yè)中多種用途 溶劑 調(diào)味品 食品添加劑 調(diào)味品 多糖 維生素 食品工業(yè) 提高油類回收率 食品添加劑 有些微生物的穩(wěn)定期培養(yǎng)物中所含有的化合物，并不在營養(yǎng)期時出現(xiàn)，而且未見到對細(xì)胞代謝功能有明顯的影響。為改進(jìn)酶的生產(chǎn)能力可以改變這些控制，如在培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物和采用菌株的誘變和篩選技術(shù)，以消除反饋阻遏作用。研究和發(fā)展計劃，總是圍繞著就逐步改善發(fā)酵的全面效益而進(jìn)行的。 5，發(fā)酵過程中對雜菌污染的防治至關(guān)重要。發(fā)酵產(chǎn)物是指在反應(yīng)過程當(dāng)中或反應(yīng)到達(dá)終點時所產(chǎn)生的能夠調(diào)節(jié)代謝使之達(dá)到平衡的物質(zhì)。在生物化學(xué)中把酵母的無氧呼吸過程稱作發(fā)酵?；谶@ —特性，可以利用廢水和廢物等作為發(fā)酵的原料進(jìn)行生物資源的改造和更新。 5，按發(fā)酵過程中對氧的不同需求來分，一般可分為：厭氧發(fā)酵和通風(fēng)發(fā)酵兩大類型。關(guān)于微生物的酶的應(yīng)用，列表總結(jié)于下表。 利用發(fā)酵生產(chǎn)的許多初級代謝產(chǎn)物，具有重大的經(jīng)濟(jì)意義，列表總結(jié)于下表中。通常，絲狀菌、真菌以及產(chǎn)芽孢的 細(xì)菌都能進(jìn)行次級代謝，而腸道細(xì)菌則都不能。一些最新型的過程，是將全細(xì)胞或其中有催化作 用的酶固定在惰性載體上。認(rèn)識了空氣在制醋過程中重要性后，終于發(fā)明了“發(fā)生器”。雖然丁醇丙酮發(fā)酵是厭氧的，但在發(fā)酵早期還是容易受到需氧菌的污染；而在后期的厭氧條件下，也會受到產(chǎn)酸的厭氧菌的污染。由于微生物蛋白質(zhì)的售價較低，所以必需比其他 發(fā)酵產(chǎn)品的生產(chǎn)規(guī)模更大些。但是要開拓新的過程，還是要依靠大量細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，它曾經(jīng)從酵母和熔劑發(fā)酵開始，經(jīng)由抗生素發(fā)酵，而到大規(guī)模連續(xù)菌體培養(yǎng)。而采用生物法即采用丙烯腈水合酶催化合成，丙烯酰胺轉(zhuǎn)化率達(dá) ％以上，比化學(xué)法成本低 10％以上。近幾年來，由于生物新技術(shù) 的應(yīng)用，發(fā)酵工業(yè)開始進(jìn)入新的發(fā)展時期。 1903 年由英德商人合辦的 “青島啤酒 ”，具有 90 多年的啤酒釀造歷史，主要致力于高檔啤酒的開發(fā)。 6，酒精 二十世紀(jì)初期，外商在東北設(shè)立哈爾濱和阿城兩個酒精廠； 1922年山東溥益酒精廠成立，為第一個由國人設(shè)立的酒精廠。 11，基因工程產(chǎn)品 我國已經(jīng)開發(fā)成功了２１種基因工程藥物和疫苗，世界上銷售額排名前１０位的基因工程藥物和疫苗，我國已能生產(chǎn)８種。 酶制劑行業(yè)有 39 家，其中萬噸以上，銷售額 2020萬以上有 8 家，其余均 在萬噸以下。待碘化鉀溶解后，于暗處放置 10min，加 250ml水，用 N硫代硫酸鈉溶液滴定，近終點時加 3ml %淀粉指示劑，繼續(xù)滴定至溶液由藍(lán)色轉(zhuǎn)變成亮藍(lán)綠色。 b 稀釋溶液 ： 2 克碘酸鉀溶于 600ml水中，再加入 96%乙醇 400ml. c 標(biāo)準(zhǔn)溶液： 溶 100ml水中， 0℃貯藏。 2 儀器 a) 帶有加熱套管的雙乙酰蒸餾器 ； b) 具有錐形瓶 (或平底蒸餾燒瓶 )的蒸汽發(fā)生瓶： 2020mL(或 3000mL) ； c) 容量瓶： 25 mL ； d) 紫外分光光度計：備有 10mm 石英比色皿或 20mm 玻璃比色皿。 4 分析步驟 試樣的處理：取試樣（ ）約 60mL 于 100mL 燒杯中，置于 (40177。 )℃的恒溫水浴中，待內(nèi)容物溫度達(dá) 20℃，并保持 5min 不變后取出?；蛴脙x器法直接自動測定、計算、打印出樣品的真正濃度及原麥汁濃度。 所得結(jié)果表示至一位小數(shù)。 水分測定方法一般采用烘干法，即在 100105℃烘箱中直接干燥。 15H2O)，用水溶解并稀釋至 1000毫升，如有不溶物可用濾紙過濾。加 2 滴 1％次甲基藍(lán)溶液，繼續(xù)用水解糖液滴定至藍(lán)色消失，此滴定操作需在 1 分鐘內(nèi)完成。 (4)滴定至終點藍(lán)色褪去之后，就不應(yīng)再滴定，因四甲基藍(lán)指示劑被還原褪色后，當(dāng)接觸空氣時，又會被氧化重現(xiàn)籃色。 稱取無水碳酸鈉 (Na2CO3)，定容至 1000m1。否則極易繁殖細(xì)菌，引起變質(zhì)。因此，根據(jù)藍(lán)色反應(yīng)的強(qiáng)弱就可推測蛋白酶的活力。 %標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液 精密稱取 經(jīng) 95~105℃烘干的無水葡萄糖，用少量水溶解，加入 5ml 鹽酸，用蒸餾水定容至 1000ml，搖勻。 ％標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液 準(zhǔn)確稱取 2 克無水葡萄糖 (預(yù)先于 100~l05℃烘干 )，用水溶解，加 5 毫升濃鹽酸，用水定容至 1000 毫升。再于相同溫度下干燥 1小時左右，同上操作，直至恒重。 實驗八 協(xié)定法糖化和外加酶糖化法 1 實驗?zāi)康模? a) 協(xié)定糖化法的實驗方法； b) 研究糖化工藝條件對麥汁組分影響； c) 了解 ?氨基氮的測定方法及其對麥汁的影響 d) 高輔料比時外加酶糖化法的研究 2 要求和實驗步驟 協(xié)定麥汁的制備步驟： A) 取 50 克麥芽，在ＥＢＣ標(biāo)準(zhǔn)磨上粉碎； B) 將已經(jīng)粉碎好的麥芽粉放入已稱重的糖化杯中，加 200ml 毫升 46℃水，于不斷攪拌下在 46℃水浴中保溫 30 分鐘； C) 使醪液以每分鐘升溫 1℃的速度，加熱水浴，升溫至 70℃。查附錄 B 中的表 B1，求得100g啤酒試樣中浸出物的克數(shù) (g/100g)。所得結(jié)果應(yīng)表示至兩位小數(shù)。 5 結(jié)果 試樣的總酸按式 (3)計算： VcX ???2 ???????????????????? (3) 式中： X —— 試樣的總酸，即 100mL試樣消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液 [c(NaOH)=] 毫升數(shù)， mL/100mL： c —— 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度， mo1／ L V —— 消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積， mL； 2 —— 換算成 100mL 試樣的系數(shù)。 顯色與測量： 分別吸取餾出液 于兩支干燥的比 色管中，并于第一支管中加入鄰苯二胺溶液，第二支管中不加 (做空白 )，充分搖勻后，同時置于暗處放置 20～ 30min，然后于第一支管中加 4mol/L 鹽酸溶液 2mL，于第二支管中加入 4mol/L 鹽酸溶液 ，混勻后，于335nm 波長下，用 20mm 玻璃比色皿，以空白調(diào)儀器零點，測定其吸光度。 G179。 4 標(biāo)定： 取 斐林溶液的 A 液，加 4ml30%醋酸溶液和 3g 碘化鉀，加 25ml 煮沸后冷卻的水，使碘化鉀溶解，以 硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定溶液呈微黃色，加硫氰酸銨 2g， %淀粉溶液 3ml，攪拌后，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失。 酶制劑由于品種的缺乏，以及應(yīng)用技術(shù)上開展不夠，因此應(yīng)用面拓展緩慢。 3，積極開發(fā)新產(chǎn)品 特鮮味精；無水檸檬酸、檸檬酸鹽；高溫α 淀粉酶；纖維素酶；β 葡聚糖酶；異淀粉酶等酶制劑； L蘋果酸； L乳酸；衣康酸；黃原膠 。目前的年產(chǎn)量為 22 萬噸左右。 沈陽華潤是一家有著濃厚外資背景的啤酒企業(yè)，資金實力較為雄厚，目前已在全國收購了沈陽雪花、四川藍(lán)劍等 24 家啤 酒企業(yè)，年生產(chǎn)能力一舉超過 200 萬噸，遠(yuǎn)遠(yuǎn)將珠江啤酒拋至身后，成為行業(yè)老三。規(guī)模較大的有五糧液、茅臺、瀘州老窖、劍南春、汾酒、古井。 傳統(tǒng)的高分子都是用化學(xué)聚合方法進(jìn)行的，近幾年，開始采用生物方法生產(chǎn)功能高分子，特別是生物可降解高分子的生產(chǎn)。應(yīng)用手性技術(shù)的最多的是制藥領(lǐng)域，包括手性藥物制劑，手性原料和手性中間體。如 ICI公司還在使用 3000M3 規(guī)模連續(xù)強(qiáng)制循環(huán)發(fā)酵罐。 第三期發(fā)酵工業(yè)的進(jìn)展，是按戰(zhàn)時的需要，在純種培養(yǎng)技術(shù)下，以深層培養(yǎng)生產(chǎn)青霉素。 在 1900 年到 1940 年間，主要的新產(chǎn)品是酵母、甘油、檸檬酸、乳酸、丁醇和丙酮。雖然在古埃及已經(jīng)能釀造啤酒，但一直到 17世紀(jì)才能在容量為 1500桶（一桶相當(dāng)于 110 升）的木質(zhì)大桶中進(jìn)行第一次真正的大規(guī)模釀造。野生型微生物只能產(chǎn)生濃度很低的次級代謝物。只有在繼續(xù)培養(yǎng)過程中，細(xì)胞 處于不生長或緩慢生長狀態(tài)時，才能實現(xiàn)次級代謝。此外，還有一些在醫(yī)療上作為診斷試劑或分析試劑用的特殊晦制劑也在深入研究和應(yīng)用。以后的發(fā)展計劃，包括連續(xù)不斷的改良菌種、培養(yǎng)基和提取過程 2，發(fā)酵過程示意圖 典型的發(fā)酵過程示意圖 3， 發(fā)酵生產(chǎn)的條件 （ 1）某種適宜的微生物 （ 2）保證或控制微生物進(jìn)行代謝的各種條件（培養(yǎng)基組成，溫度，溶氧 pH 等） （ 3）進(jìn)行微生物發(fā)酵的設(shè)備 （ 4）提取菌體或代謝產(chǎn)物，精制成產(chǎn)品的方法和設(shè)備 五，發(fā)酵工業(yè)范圍 1，釀酒工業(yè) (啤酒、葡萄酒、白酒等 ) 2，食品工業(yè) (醬、醬油、醋、腐乳、面包、酸乳等 ) 3，有機(jī)溶劑發(fā)酵工業(yè) (酒精、丙酮、丁醇等 ) 4，抗生素發(fā)酵工業(yè) (青霉素、鏈霉素、土霉素等 ) 5，有機(jī)酸發(fā)酵工業(yè) (檸檬酸、葡萄糖酸等 ) 6，酶制劑發(fā)酵工業(yè) (淀粉 酶、蛋白酶等 ) 7，氨基酸發(fā)酵工業(yè) (谷氨酸，賴氨酸等 ) 8，