【正文】 值得注意的是： ① 有些載體不含終止序列 ， 表達(dá)外源蛋白質(zhì)時(shí)也可獲得較滿意的結(jié)果（ 基因轉(zhuǎn)錄之外順序可影響轉(zhuǎn)錄終止 ） ； ② 多數(shù)外源蛋白質(zhì)表達(dá)載體帶有合適的終止順序； ③ 轉(zhuǎn)錄終止順序有長有短 ， 短的長約 700－ 800bp。 62 /沉默子 （ enhancer， E/silencer（ negatire enhancer） （ 1） 概念 為真核基因組 （ 包括真核病毒基因組 ） 中的一種具有增強(qiáng)鄰近基因轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控順序 。 ② 這個(gè) DNA區(qū)域常在基因或操縱子編碼順序的上游 （ up－stream） ， RNApol結(jié)合在上面 ， 指導(dǎo)酶朝向正確的轉(zhuǎn)錄位置 。 （ 3） 一般情況下 ， 一個(gè)質(zhì)粒只含一個(gè) ori， 構(gòu)成一個(gè)獨(dú)立的復(fù)制子 。 50 三 、 基因工程載體的 3個(gè)特點(diǎn)： （ 一 ） 都能獨(dú)立自主的復(fù)制 載體 DNA分子中有一段不影響它們擴(kuò)增的非必需區(qū)域 ， 如 MCS， 插在其中的外源 DNA片段 ， 能被動(dòng)的跟著載體一起復(fù)制 /擴(kuò)增 ， 就像載體的正常成分一樣 。 （ 2） 與限制酶協(xié)作 →建立物理圖譜 。 目前已發(fā)現(xiàn) T4DNA pol的忠實(shí)性較上二者好 ， 其堿基錯(cuò)誤摻入頻率107。 （ 2） 酶的活性 與 Klenow片段 （ 酶 ） 相似 ， 有 5’ － 3’ 聚合活性以及 3’ － 5’ 外切酶活性 ， 無 5’ － 3’ 外切酶活性 。 （ 3） 5′→3′外切酶活性： 從游離的 5’ 端降解 dsDNA成單核苷酸或寡核苷酸 ， 也降解DNA:RNA雜交體 RNA成分 （ 具有 RnaseH活性 ） 5’ － CTCATTAG－ 3’ DNA polⅠ 5’ － CATTAG 3’ － GCGTAATC－ 5’ Mg2＋ 3’ － GCGTAATC +pC,pG 33 2. DNA polⅠ (DNA polⅠ )在基因工程的應(yīng)用： （ 1） 制備高比活性的探針 DNA polⅠ 可催化 DNA缺口移位反應(yīng) （ Nick translation） ， 為基因工程制備高比活性放射性探針 （ 放標(biāo) ， 非放標(biāo) ，32P， 地高辛 ） 5’ ―――――――― 3’ 3’ ―――――――― 5’ dsDNA Mg2＋ ↓DNA酶 Ⅰ 5’ —3’ （ 3’ —5’ ） ↓32P dNTP,DNA polⅠ （ 全酶 ） 5’ ― 3’ 3’ ― 5’ （ 參缺口平移法圖解 ） （ 2） 用于分子克隆 （ 填充缺口利于重組 ） DNA polⅠ 能填充 DNA的小缺口區(qū) （ Gapped region） →以便有效在體外用于 DNA分子重組 ， 如： ① 切割 cccdsDNA分子作載體時(shí) ② 插入一段不具粘性末端的 DNA片段或加入 1個(gè)同源順序 ssDNA片段 ③ 此時(shí)用 DNA polⅠ 填充這個(gè)缺口 ④ 再用 ligase(3’ OH,P5′)連接 ， 組成重組 DNA分子 。 （ 3） 對(duì)粘性末端催化活性大于平頭末端 （ 酶量 1： 100） 30 三 、 逆轉(zhuǎn)錄酶 （ 一 ） 概述 逆轉(zhuǎn)錄酶也稱反轉(zhuǎn)錄酶或 RNA依賴的 DNA聚合酶（ RNA dependent DNA polymerase,RDDP） 。 HgaⅠ 識(shí)別位點(diǎn) GACGC→5/10(核苷酸距離 )→dsDNA上切割 5ˊ GACGC NNNNN↓ NNNNN 3ˊ 3ˊ CTGCG NNNNN NNNNN↑ 5ˊ 先識(shí)別 （ 搞清楚 ） 滑行一段距離再切 ， 此稱為 Di s ta nt cleavage 25 (三 )限制酶的切割位點(diǎn)： 限制性對(duì) dsDNA 2條鏈同時(shí)切割 （ 其具體切割點(diǎn) ， 即磷酸二酯鍵斷開的位點(diǎn) ， 相對(duì)二重對(duì)稱軸的位置而異 ） 產(chǎn)生 3種不同切口： 1． 形成平頭末端 （ flush或 bluntend） 如 － TC↓GA smaⅠbsuRⅠ or – TC3ˊ+ 5ˊGA － AG↓ CTAluⅠ AG5ˊ+ 3ˊCT 5′ －粘性末端 （ 5′ － cohesive end即 3′ 延伸末端 ） 5′ GAATTC3′ EcoRⅠ 5′ G AATTC3′ + 3′ CTTAAG5′ 3′ CTTAA G5′ 3′ －粘性末端 （ 3′ － cohesive end） 5′ CTGCAG 3′ pstⅠ G3′ 5′ CTGCA + 3′ GACGTC 5′ ACGTC5′ 3′ G 粘性末端 （ sticky end） — 限制酶切割產(chǎn)生 2個(gè)突出的末端稱之 ，作用是放在一起自發(fā)形成雙鏈 。所有的限制酶可分成 3類 。 在合適的生理環(huán)境中進(jìn)行無性繁殖 ，從而利用宿主的生理機(jī)制繁衍人們所需要的基因結(jié)構(gòu) ， 并進(jìn)行表達(dá) 。 3. 20世紀(jì) 60年代 ， 確定了遺傳信息的傳遞方式 ：DNA→ RNA→ Pr,破譯了全部遺傳密碼 ， 43。這一消息的公布 ， 全世界震驚的程度不亞于原子彈在長崎和廣島的爆炸 ， 在全球引起了軒然大波 ， 以至世人驚呼：不要讓科學(xué)瘋狂 ！ 為什么以前胚胎克隆沒有在世界上引起軒然大波呢 ?原因是此克隆非彼克隆 ， 多利取自功能徹底分化的成年動(dòng)物乳腺細(xì)胞 ， 即體細(xì)胞 。因?yàn)橥ㄟ^人工設(shè)計(jì) ,得到一定的設(shè)計(jì)方案，故稱為基因工程。 2 第一節(jié) 概 述 一 .現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)發(fā)展的 3個(gè)特點(diǎn)： （一）科學(xué)技術(shù)加速發(fā)展和急劇變革： ，全世界發(fā)表科技論文 6000－ 8000/天，平均 1篇 /。 基因工程既是科學(xué)又是技術(shù)，既是突破，又是融合。 ， 保證生物種的延綿不斷（ 不能斷香火 ） 。 13 從家庭倫理角度看，將克隆技術(shù)用于人體繁殖，會(huì)加劇家庭多元化傾向，還會(huì)從根本上改變?nèi)说挠H系關(guān)系，確定人類親系關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)也將發(fā)生改變。 （ 原因如下 ） ( 1 )真核基因組龐大而復(fù)雜 ， 不易制得基因圖譜 。 （ 1） 基因工程： ① DNA重組； ② DNA體外誘變； ③ 體外基因操作； ④ 基因化學(xué)合成等 。 （ 3） 識(shí)別順序呈二重對(duì)稱 ， 即 1800旋轉(zhuǎn)對(duì)稱 。 對(duì)于限制反應(yīng)機(jī)制 ， 盡管書上列出 1，2步反應(yīng) ， 但人們更關(guān)注他的應(yīng)用 。 5. DNA解旋酶 類似 unwinding。 35 （ 二 ） 大腸桿菌 DNA聚合酶 Ⅰ 的大片段－ Klenow片段酶 基因工程很多情況下 ， DNA polⅠ 可用它的 1個(gè)大片段Klenow片段酶代替 。 Taq pol最是反應(yīng)溫度是 75℃ 左右 ， 而退火溫度可在 55－70℃ ， 因而 Taq pol可顯著提高引物退火特異性 ， 避免了引物與模板非特異性產(chǎn)物的合成 。 ② 打開 cDNA中的發(fā)夾環(huán) ， 使其成平端 。 （二）去除 5ˊ P，防止 DNA片段或載體自身環(huán)化。 這樣一個(gè)基因表達(dá)需要的具有表達(dá)和調(diào)控能力的載體稱表達(dá)載體 。 （ 2） tetr 1個(gè)膜蛋白 可以阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞 。（ Tubulin） 60 用于原核表達(dá)系統(tǒng)的強(qiáng)啟動(dòng)子① Lac→② Lacuv5→③Trp→④ Tac→⑤ λPL→⑥ T7 名 稱 來 源 組 成 正 調(diào) 控 負(fù) 調(diào) 控 備 注 1． Lac （ 1） Pg（啟動(dòng)基因）；（ 2） CAP（降解物激活蛋白基因）；（ 3） O（操縱子）；（ 4） S（部分 β－半乳糖苷酶結(jié)構(gòu)基因）。 這段序列富含嘌呤核苷酸 ， 剛好與 16sRNA富含嘧啶的序列互補(bǔ) ， 是 RNA識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn) 。 67 (xbal I) EcoRI EcoRI (Hind III) PUC
。如增強(qiáng)子的荃環(huán)利于與反式因子結(jié)合 。 原核生物 40－ 60bp 真核生物啟動(dòng)子 識(shí)別位點(diǎn) － 35bp（ α2ββσ） TATA因子 （ TFⅡ D） 先結(jié)合 TATAbox， 再結(jié)合RNApol 結(jié)合位點(diǎn) － 10bp（即 TATA合） － 25bp，富含 AT稱為TATA合或 Hogness合，與 RNApolⅡ 結(jié)合。 ④ 基因工程使用松弛型質(zhì)粒 ， 如含 PBMI復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒 。 （ Expression vector） 具有克隆載體的基本元件 （ ori,Ampr,Mcs等 ） 還具有轉(zhuǎn)錄 /翻譯所必需的 DNA順序的載體 。 44 七、堿性磷酸酶（ alkaline phoptase, APE） APE包括 BAP（細(xì)菌堿性磷酶和 CIP（小腸堿性磷酶）。 、 中 、 極高 3種情況變化－ (1)降解 ssDNA或 ssRNA形成 5’ p末端的單或寡核苷酸 ， 對(duì) DNA活性強(qiáng)于 RNA,如： ssDNA或 ssRNA SI， PH4,5 Zn2＋ 5ˊpdN 或 5ˊprN (2)中量 SI可從切口 （ Nick） 或小缺口 （ small gaps） 處降解 dsDNA， (3)極大量的 SI才能講解 dsDNA或 DNARNA雜交鏈 ， 原因是后者對(duì)SI講解有抗性 ， 所以 SI又稱單鏈特異的核酸酶 。 38 Taq pol主要考慮下述 5個(gè)參數(shù) （ PCR） （ 1） 熱穩(wěn)定性 PCR cycle中 ， DNA變性處理通常 30－ 60秒 ，按 30個(gè)循環(huán)累計(jì)熱變性時(shí)間為 15－ 30分鐘 ， Taq pol連續(xù)保溫 30分鐘后 ， 仍保持相對(duì)高的活力 。 生長鏈沿著引物延伸至缺少的那個(gè) dNTP為止 。 3. RnaseH 外切 RNA酶活性 ， 底物是 RNA－ DNA雜交分子 RNA鏈 ，有兩種： ① 5′→3′外切 RNA， 稱 5′→3′外切 RNA酶； ② 3′→5′外切 RNA酶 ， 稱 3′→5′外切 RNA酶 ， 也稱 RnaseH。 27 (五 )限制酶得正常識(shí)別切割能力是 buffer的或幾個(gè)因子的函數(shù) （ 1－ 8等 ） 度 、 純度 ： Mg2+、 Mn2+、 Co2+、 Zn2＋ ：甘油 、DMSO、 甲酰胺 Polisky證明 ， Mgcl2從 5mM下降至 2mM， pH值上升到 ， EcoRI專一性從 6bp下降至 4bp即 NAATN,這種識(shí)別 AATT的 EcoRI稱 EcoRI*。 （ 2） 它能 識(shí)別 dsDNA的 4－ 6bp的回文序列并水解該部分的核苷鍵 。 基因工程包括 DNA重組技術(shù) ， 現(xiàn)將相關(guān)的概念關(guān)系列表如下 。 這是基因工程的第二個(gè)技術(shù)準(zhǔn)備 。 12 （ 四 ） 此克隆非彼克隆 胚胎細(xì)胞克隆 體 細(xì) 胞 克 隆 供體細(xì)胞 胚胎細(xì)胞 （ 核 ） 體細(xì)胞 （ 核 ） 受體細(xì)胞 去核未受精的卵細(xì)胞 去核未受精的卵細(xì)胞 發(fā)育場所 母體宮腔 母體宮腔 關(guān)鍵區(qū)別 克隆的是子代 （ 多生了一個(gè) ） 復(fù)制的是自己 （ 復(fù)制了一個(gè) ） （ 五 ） 克隆是一把雙刃劍 試想，有了克隆技術(shù)，有人在你毫不知曉的情況下復(fù)制一個(gè)“你”去犯罪，怎么辦？試想，有了克隆技術(shù)，一些極權(quán)的政治野心家一下子克隆出好幾個(gè)戰(zhàn)爭狂人希特勒、墨索里尼，怎么辦？還有，有了克隆技術(shù)，世界上同時(shí)生活著多個(gè)你、我、父母、兄弟、姐妹，按現(xiàn)行的社會(huì)倫理道德很難為其“名份”定位，又該怎么辦？因此說克隆對(duì)人類社會(huì)倫理道德提出了一場非同尋常的挑戰(zhàn)，