【正文】 人們最感興趣之一的便是細(xì)胞因子。我們將細(xì)胞種在上室內(nèi)，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞，從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對細(xì)胞生長、運(yùn)動(dòng)等的影響 。 ? 與細(xì)胞因子相關(guān)的疾病舉例： ? 慢阻肺：以中性粒細(xì)胞為主的多種炎性細(xì)胞活化后釋放過量的炎癥介質(zhì)，促進(jìn)氣道反復(fù)損失與修復(fù)，導(dǎo)致氣道重塑，引起狹窄，固定性氣流阻塞。 髓系細(xì)胞： GMCSF， GCSF， MCSF。胞外區(qū)有 35個(gè)由 40個(gè)氨基酸殘基組成的重復(fù)亞單位；每個(gè)重復(fù)亞單位含有 46個(gè)保守的半胱氨酸；形成 “ 配體結(jié)合區(qū)域。 活化的淋巴細(xì)胞 TGFβ 水平增高。 ? IFNγ 上調(diào) MHCI類、 II類分子的表達(dá)； 促進(jìn) Th1細(xì)胞分化； 激活 NK、巨噬細(xì)胞； 抑制 Th2細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞。 TDF ( thymocyte differentiation factor )。 6 27 傳統(tǒng)生物學(xué)策略 發(fā)現(xiàn)生物活性－鑒定細(xì)胞因子蛋白－克隆基因－細(xì)胞表型－動(dòng)物模型－人體內(nèi)功能及與疾病關(guān)聯(lián) 反向生物學(xué)策略 數(shù)據(jù)庫 DNA序列 －生物信息學(xué)－蛋白質(zhì)表達(dá)－細(xì)胞表型－動(dòng)物模型－人體內(nèi)功能及與疾病關(guān)聯(lián)。 Interleukin 來自 interleukin，意指白細(xì)胞之間信使分子，中文譯為白細(xì)胞介素。 22 34 IL2 ? 1976發(fā)現(xiàn) ,1979年命名 ,1983年克隆成功 ? 1965年發(fā)現(xiàn)混合白細(xì)胞培養(yǎng)上清中存在一種可溶性因子，可促進(jìn)細(xì)胞生長，命名為母細(xì)胞形成因子 （ Blastogenic Factor， BF) ? 1976年發(fā)現(xiàn)小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中含有一種刺激胸腺細(xì)胞生長的因子，故稱為 T細(xì)胞生長因子 （ T cell growth factor，TCGF） ? 1979年統(tǒng)一命名為白細(xì)胞介素 2（ interleukin 2， IL2） ? IL2別名 – BF ( blastogenic factor )。 TSF ( thymocyte stimulating factor ). ? 1983年 Taniguchi從 ConA刺激的 Jurkat白血病 T細(xì)胞中克隆成功 – IL2含有 133aa，分子量為 – N端有糖基化修飾 – 三個(gè)半胱氨酸： 5 10 125位 ? IL2主要產(chǎn)生細(xì)胞： – 主要由活化 CD4+ Th1分泌 ,CD8+T和 NK也能產(chǎn)生 – T細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系 :如人 Jurkat和小鼠 EL4 – T淋巴細(xì)胞雜交瘤 :、 HT24A等 ? IL2受體： CD25(α)； CDl22(β)； CDl32(γc) IL2的生物學(xué)活性 ? 作用具有沿種系譜向上有約束性，向下無約束性： 促進(jìn)活化的 T細(xì)胞進(jìn)入 S期，維持細(xì)胞的增殖，刺激產(chǎn)生： MHCII， IFNγ ， IL 6， LTα ， CSF。 ? 1984, TNFa的 cDNA得以克隆，后來相繼克隆了該家族的多個(gè)成員，構(gòu)成了 TNF超家族細(xì)胞因子。 、抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生：如 TNFα/β ， IFNγ ， IL4， IL12 上皮間質(zhì)變遷 （ epithelialmesenchymal transition,EMT） EMT是細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的一種方式。 淋巴細(xì)胞 內(nèi)皮細(xì)胞 中性粒細(xì)胞 C類趨化因子 CX3C 類趨化因子 N端前兩個(gè)半胱氨酸之間含有其他 3個(gè)氨基酸殘基 染色體主要定位于 16q13 T淋巴細(xì)胞 單核細(xì)胞 NK細(xì)胞 Fractalkine 膜結(jié)合型 分泌型 ? 介導(dǎo)細(xì)胞間的粘附，并傳遞活化信號 ? 行使細(xì)胞趨化功能 N端只含兩個(gè)半胱氨酸 染色體主要定位于 1q23 T細(xì)胞 骨髓細(xì)胞 XCL1/Lymphotactin XCL2/SCM1β CXCR4和 CCR5是 HIV感染的共受體 (Co receptors) 2. CXCR4（ T細(xì)胞）與 CCR5（巨噬細(xì)胞） 是 HIV感染靶細(xì)胞的共受體。：定向遷移（ CCL18,1215）、活化（ IFNγ ，GMCSF, MCSF）、促抗原提呈 (IFNγ )。 ? 急性肺損傷 /急性呼吸窘迫綜合癥：是在致病因子的作用下發(fā)生的過度炎癥反應(yīng)，細(xì)胞因子 TNF,IL8， IL1β 等在其發(fā)生發(fā)展中都起了重要的作用。 免疫學(xué)檢測法 (1) ?可溶性細(xì)胞因子檢測 : – 放射免疫測定（ RIA） 特異 Ab包被 +待測樣品和同位素標(biāo)記的細(xì)胞因子 竟?fàn)幰种茖?shí)驗(yàn) – 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ ELISA） 雙抗體加心法 – Western Blot – 檢測單個(gè)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子：細(xì)胞斑點(diǎn)、酶聯(lián)斑點(diǎn) 免疫學(xué)檢測法 (2) ? 細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞膜上的細(xì)胞因子的研究 – 檢測單個(gè)細(xì)胞結(jié)合的細(xì)胞因子：生物素、堿性磷酸酶、免疫熒光 – 檢測細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子 細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子的熒光檢測 分子生物學(xué)檢測 ? Southern Blot ? Northern Blot ? 原位雜交 ? RTPCR 體內(nèi)功能研究 ? 基因敲除、轉(zhuǎn)基因 ? 利用特異性抗體觀察細(xì)胞因子在體內(nèi)的生物學(xué)作用 細(xì)胞因子的應(yīng)用 ? 在臨床治療： ? 重組細(xì)胞因子： – 抗腫瘤細(xì)胞因子： IL IFNa – 促進(jìn)造血的細(xì)胞因子： GCSF、 GMCSF、 EPO、 IL11 – 最近發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子可以增強(qiáng)化療藥治療白血病的療效。 思考題 （ 2個(gè)以上細(xì)胞因子）。 Yrina Rochman et al. Nature Bubbleboy (IL2R的 γ鏈缺陷引起 SCID) XSCID 基因治療原理 表達(dá)細(xì)胞因子 VEGF的腺病毒或裸 DNA直接體內(nèi)注射 治療梗塞性血管病 細(xì)胞因子佐劑 細(xì)胞因子在免疫應(yīng)答的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)中具有重要作用，可作為免疫佐劑增強(qiáng)疫苗的免疫效果。 ? Cell Counting Kit8簡稱 CCK8試劑盒，是一種基于 WST8的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。 The EMBO Journal (2022), 1–10 CKR在 DC遷移和功能成熟中具有不同的表達(dá)模式 CXCL8參與 Neu的遷移和活化 趨化因子參與免疫細(xì)胞在周圍免疫器官的定位 趨化因子及其受體在免疫系統(tǒng)的表達(dá)和功能 Ye H. Oo et al, Journal of Autoimmunity 34 (2022) 45–54. （ 1） B：促增殖、活化、分化： IL4， 5， 6， 13， BAFF； 調(diào)控 Ig類別轉(zhuǎn)換： IL4， 5等。 ? IL1受體拮抗劑 ? 病毒產(chǎn)生的細(xì)胞因子結(jié)合蛋白， TNF， IL1 細(xì)胞因子受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo) ?細(xì)胞因子受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)主要利用 2個(gè)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑： – JAK(Janus kinase)STAT – Ras－ MAPK激酶途徑 細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo) Cytokine induced signal transduction 細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)與功能特點(diǎn) ? 結(jié)構(gòu)：同源性低，小分子蛋白，多為單鏈，少為雙鏈、三聚體（ TNF）、多含糖基 ? 量微而活性強(qiáng)（ pmol/L） 細(xì)胞因子作用是作為細(xì)胞之間的信使 細(xì)胞因子作用特點(diǎn)： ? 旁分泌或自分泌，瞬時(shí)、距離范圍小 ? 通過與相應(yīng)受體結(jié)合發(fā)揮作用 ? 細(xì)胞因子誘導(dǎo)的受體亞單位聚合可以活化蛋白酪氨酸激酶 (JAK),導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子 STAT酪氨酸磷酸化而激活靶基因轉(zhuǎn)錄 ? 多效性、重疊性、拮抗性、協(xié)同性、網(wǎng)絡(luò)性： 生理調(diào)節(jié)、病理反應(yīng) 90 細(xì)胞因子間可相互誘生： IL1能誘生 IFN、 IL IL IL4等， IL2能誘生 TNF、 IL LT等。 與 EMT相關(guān)分子 ? 許多抑癌基因的功能喪失性突變或表達(dá)下調(diào)與 EMT有關(guān) ,如： APC,CDH1,β catenin， PTEN等 , ? 許多生長因子參與了 EMT,如 EGF,TGFβ,HGF,FGF 等，特別是 TGFβ 在 EMT中起到了重要作用，在多條通路中都發(fā)揮作用 vector AKT/Δ AKT Transient adV 4Day＋ Stable Sylvia Julien Grille et al., “The Protein Kinase Akt Induces Epithelial Mesenchymal Transition and Promotes Enhanced Motility and Invasiveness of Squamous Cell Carcinoma Lines,” Cancer Res 63, no. 9 (May 1, 2022): 21722178. 一個(gè)新的抑制 EMT細(xì)胞因子的發(fā)現(xiàn) Part Ⅱ . ECadherin redistribution amp。 L選擇素 SLex 整合素 ICAM1 粘附 內(nèi)皮細(xì)胞 炎癥 趨化因子 5. 趨化因子 (Chemokine， CK): 能使細(xì)胞發(fā)生趨化運(yùn)動(dòng)的小分子蛋白。 ? 成熟的 IFNβ 有 166個(gè)氨基酸 ,3