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正文內(nèi)容

bdfacscalibur中文操作手冊(cè)cellquest軟件(專(zhuān)業(yè)版)

  

【正文】 注意: 1. 限定邏輯門(mén)時(shí),在 and 、 or、 region 之間需空格。在 CellQuest 中,默認(rèn) G1=R1, G2=R2,但可以根據(jù)需要設(shè)定合適的門(mén) 。 5. 12. 1 設(shè)置 Region 1.選擇文件目錄及文件名 2.在工具板中選擇適當(dāng)形式的 Region,在 FSC/SSC點(diǎn)圖上將淋巴細(xì)胞圈上。 若 4色,從同型對(duì)照管的 FL1H/FL4H點(diǎn)圖上得出門(mén)內(nèi)細(xì)胞 %LL(左下象限)。若二色分析,則需 6管。 9.使儀器處于 Standby狀態(tài)。 5.在 Custom Prefix中:輸入文件名 6.在 File Name Suffix中選擇 File Count 7.在 File Count 中:確認(rèn)輸入的為 1 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊(cè) 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 16 8.點(diǎn)擊此對(duì)話框的 OK 9.在 Parameter Description對(duì)話框中輸入您想保存的 Patient ID, Sample ID, Comments等信息。 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊(cè) 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 14 5. 7 實(shí)驗(yàn)練習(xí): 3色 /4色預(yù)獲取 在此練習(xí)中,您將: ? 設(shè)定 Acquisition(獲取)和 Storage(儲(chǔ)存)的條件。 1.從 Cytometer 菜單中選擇 Compensation 2.插上 CD3FITC/小鼠 IgG1PE/小鼠 IgG1PerCP/小鼠 IgG1APC管。 10.從 Status窗口選擇 Quadrant Stas(象限統(tǒng)計(jì))。 3.移去同型對(duì)照管,點(diǎn)擊 Acqusition Control 窗口中的 Pause。出現(xiàn) Acqusition Control 對(duì)話框。 小鼠 IgG1FITC/小鼠 IgG1PE/CD45PerCP/小鼠 IgG1APC。一個(gè)細(xì)胞 首先通過(guò)紅色激光束,幾微秒后通過(guò)藍(lán)色激光束。247。它們?cè)陲@示上有三種形式 (見(jiàn)圖 6): 激活 : 外框呈灰色。 FITC主要出現(xiàn)在 FL1探測(cè)器上,但也有 部分重疊到 FL2探測(cè)器上。當(dāng)電壓上升時(shí),信號(hào)增加,數(shù)據(jù)出現(xiàn)在道值較高處。 它將用 于調(diào)節(jié) FSC、 SSC、 FSC閾值、設(shè)淋巴細(xì)胞 region、確認(rèn)FL1/FL2/FL3/FL4的設(shè)置及象限設(shè)置。 注意:實(shí)驗(yàn)文件和它的數(shù)據(jù)文件之間存在一定限制。 8. 象限 marker:點(diǎn)擊,可在點(diǎn)圖、密度圖和等高圖上定位 marker 。 獲取 即收集并儲(chǔ)存流式細(xì)胞儀上數(shù)據(jù)的過(guò)程。 工具板按鈕 (見(jiàn)圖 1) BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊(cè) 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 2 1. 等高圖:點(diǎn)擊,可畫(huà)等高圖,可自定義圖的大小。 CellQuest 的文件: FCS list mode數(shù)據(jù)文件 :是流式細(xì)胞儀的標(biāo)準(zhǔn)格式數(shù)據(jù)文件( )。一個(gè)實(shí)驗(yàn)文件可含上述 3種圖的組合,但獲取圖不能用來(lái)分析,分析圖不能用來(lái)獲取。 (見(jiàn)圖 2) BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊(cè) 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 4 E00:將信號(hào)放大 1(100)倍。每次只能有一個(gè)參數(shù)設(shè)置閾值 (FSC、 SSC、 FL FL FL3)。 Standby時(shí)儀器的激光器電源降低。若需全選,可從 Edit 菜單中選擇select all。 在進(jìn)行 3色或 4色獲取時(shí)依下列程序進(jìn)行: 開(kāi)儀器后開(kāi)計(jì)算機(jī),以確保儀器和計(jì)算機(jī)之間的正常通訊。 優(yōu)化: 在此練習(xí)中,您將: ? 建立 CellQuest 實(shí)驗(yàn)文件。出現(xiàn)點(diǎn)圖對(duì)話框。 5. 6. 4 調(diào)節(jié) FSC/SSC 探測(cè)器(電壓)及 FSC 閾值 在 FSC/SSC點(diǎn)圖上調(diào)節(jié) FSC放大器增益和 SSC電壓是為了將所感興趣的細(xì)胞顯示在圖中。 1.選擇點(diǎn)圖 2.在出現(xiàn)的對(duì)話框內(nèi)選擇 X軸: FL1, Y軸: FL2 3.選擇 G1=R1 4.點(diǎn)擊 OK, FL1/FL2的點(diǎn)圖出現(xiàn) 5. 點(diǎn)擊 FL1/FL2點(diǎn)圖的邊框并將之拖至 FSC/SSC圖的右側(cè) 6.同樣建立一個(gè) FL3/FL2的點(diǎn)圖,并選擇 G1=R1。若 3色樣本,必要時(shí)需調(diào)節(jié) FL2%FL1, FL1%FL2,F(xiàn)L3%FL2, FL2%FL3的補(bǔ)償。 11.查看 FL4%FL3的補(bǔ)償,應(yīng)為 %,若必要,調(diào)節(jié)該補(bǔ)償。只有被選參數(shù)才儲(chǔ)存在 Data file中。此前已用樣本細(xì)胞優(yōu)化過(guò)條件,獲取和儲(chǔ)存的門(mén)及顆粒數(shù)已設(shè)定、文件的儲(chǔ)存已設(shè)定。出現(xiàn) Instrument Setting窗口。 若分析 3色數(shù)據(jù),跳至 , 若分析 4色 , 請(qǐng)參見(jiàn) BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊(cè) 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 21 5. 11. 3 分析四色 1. File菜單下的選擇文件大小 ,文件大小對(duì)話框出現(xiàn)。 5. 11. 8 將統(tǒng)計(jì)改為電子表格 將在分析中儲(chǔ)存的輸出文件改為電子表格。從 Gate 菜單中選擇 Stop Edit Region即可停止。 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊(cè) 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 25 2.為將 嗜堿粒細(xì)胞群落顯示銹色,在 Gate list中將 G5移至首位。 12.從 Stats菜單選擇 Histogram Stats(直方圖 統(tǒng)計(jì)),注意 M2統(tǒng)計(jì)結(jié)果。 更改 Gate list 中門(mén)的次序: 門(mén)內(nèi)細(xì)胞群的顏色是依 Gate list中的門(mén)的次序而定,可更改 Gate list的次序,而改變門(mén)內(nèi)細(xì)胞群的顏色。在 Region邊界上 雙擊,或在 Region邊界上點(diǎn)擊一次、然后從 Gate 菜單中選擇 Edit Ploygon。 4.關(guān)閉 info 窗口。該點(diǎn)圖分為 4個(gè)象限, UL:左上,僅 FL2+ UR:右上, FL1+和 FL2+ LL:左下, FL1和 FL2 LR:右下,僅 FL2+ 在小鼠 IgG1FITC/小鼠 IgG1PE(同型對(duì)照)的 FL1H/FL2H點(diǎn)圖上,幾乎所有的細(xì)胞應(yīng)在 LL象限。 3.在 Instrument Setting窗口中點(diǎn)擊 Done。點(diǎn)擊 OK 7.可在 Parameter Description對(duì)話框中選擇剛剛編輯的試劑 Panel。然后數(shù)據(jù)按 Collection Criteria 窗口中的設(shè)置處理。 10.查看 FL2%FL3的補(bǔ)償,應(yīng)為 %,若必要,調(diào)節(jié)該補(bǔ)償。 17.移去同型對(duì)照管。特定抗體 Fab端與細(xì)胞表面上特定抗原的特異結(jié)合所發(fā)的熒光為陽(yáng)性熒光。將其拖至空白區(qū)。 6. 從工具板中選擇點(diǎn)圖:點(diǎn)擊工具板中點(diǎn)圖圖標(biāo)。當(dāng)打印對(duì)話框出現(xiàn)時(shí),點(diǎn)擊 OK。 3色:用 FACSComp進(jìn)行 PMTs設(shè)置、補(bǔ)償調(diào)節(jié)、敏感度測(cè)試。任何命令可 影響被選擇的圖。 測(cè)試脈沖: 在 FACSCalibur中可從 status菜單中選擇 FSC(僅 FSC探測(cè)器上產(chǎn)生的信號(hào) )或ALL(所有探測(cè)器上產(chǎn)生的信號(hào) )或 OFF。 對(duì)數(shù)常用 于 分開(kāi)陰性信號(hào)和弱陽(yáng)性信號(hào)。 光電二極管用于探測(cè) FSC,因?yàn)?FSC是強(qiáng)信號(hào)。 ? 實(shí)驗(yàn)文件可轉(zhuǎn)化為文具薄。 16. 文本:點(diǎn)擊,然后點(diǎn)擊定位插入點(diǎn)并編輯文字。 工具板 工具欄可用來(lái)畫(huà)圖、 region, marker和文字等。 分析 將獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析。 10. 放大:點(diǎn)擊,然后點(diǎn)擊圖,將縮小圖放大到原大小。若二者聯(lián)系喪失,需將丟失的數(shù)據(jù)文件放在其實(shí)驗(yàn)文件同一目錄,實(shí)驗(yàn)文件才能找到其數(shù)據(jù)文件。 調(diào)節(jié)探測(cè)器和放大器可使所需信號(hào)出現(xiàn)在數(shù)據(jù)圖的適當(dāng)位置。 (見(jiàn)圖 2) 放大器 : 可對(duì)信號(hào)進(jìn)行微調(diào)。 補(bǔ)償調(diào)節(jié)如下: FL2-% FL1: 從 FL2探測(cè)器上減去重疊的 FL1 FL1-% FL2: 從 FL1探測(cè)器上減去重疊的 FL2 FL3-% FL2: 從 FL3探測(cè)器上減去重疊的 FL2 FL2-% FL3: 從 FL2探測(cè)器上減去重疊的 FL3 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊(cè) 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 5 補(bǔ)償調(diào)節(jié)量依賴于探測(cè)器的電壓。每次只能激活一個(gè)圖。 ? 在獲取中,設(shè)定數(shù)據(jù)收集和儲(chǔ)存。 FL3和 FL4經(jīng)不同PMTs探測(cè)。 1. 先開(kāi)儀器后開(kāi)計(jì)算機(jī),以確保儀器和計(jì)算機(jī)之間的正常通訊。 13. 從 Cytometer菜單中選擇 Detectors/Amps。若必要,將這群細(xì)胞調(diào)在所有圖的左下角。 12.插上同型對(duì)照管 13.點(diǎn)擊 Aqusition Control窗口中的 Restart。 4.若必要,調(diào) 節(jié) FL2%FL1使 FITC+細(xì)胞在 FL1/FL2點(diǎn)圖的右下象限。 Storage 窗口 在此窗口可設(shè)定獲取和儲(chǔ)存的顆粒數(shù)及類(lèi)型。 輸入:在 P1后的空格中輸入?yún)?shù)名。 5. 9 儲(chǔ)存、恢復(fù) 儀器設(shè)置
點(diǎn)擊復(fù)制文檔內(nèi)容
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