【正文】 注意： 1. 限定邏輯門(mén)時(shí)，在 and 、 or、 region 之間需空格。在 CellQuest 中，默認(rèn) G1=R1， G2=R2，但可以根據(jù)需要設(shè)定合適的門(mén) 。 5． 12． 1 設(shè)置 Region 1．選擇文件目錄及文件名 2．在工具板中選擇適當(dāng)形式的 Region，在 FSC/SSC點(diǎn)圖上將淋巴細(xì)胞圈上。 若 4色，從同型對(duì)照管的 FL1H/FL4H點(diǎn)圖上得出門(mén)內(nèi)細(xì)胞 %LL（左下象限）。若二色分析，則需 6管。 9．使儀器處于 Standby狀態(tài)。 5．在 Custom Prefix中：輸入文件名 6．在 File Name Suffix中選擇 File Count 7．在 File Count 中：確認(rèn)輸入的為 1 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊(cè) 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 16 8．點(diǎn)擊此對(duì)話框的 OK 9．在 Parameter Description對(duì)話框中輸入您想保存的 Patient ID， Sample ID， Comments等信息。 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊(cè) 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 14 5． 7 實(shí)驗(yàn)練習(xí)： 3色 /4色預(yù)獲取 在此練習(xí)中，您將： ? 設(shè)定 Acquisition（獲取）和 Storage（儲(chǔ)存）的條件。 1．從 Cytometer 菜單中選擇 Compensation 2．插上 CD3FITC/小鼠 IgG1PE/小鼠 IgG1PerCP/小鼠 IgG1APC管。 10．從 Status窗口選擇 Quadrant Stas（象限統(tǒng)計(jì)）。 3．移去同型對(duì)照管，點(diǎn)擊 Acqusition Control 窗口中的 Pause。出現(xiàn) Acqusition Control 對(duì)話框。 小鼠 IgG1FITC/小鼠 IgG1PE/CD45PerCP/小鼠 IgG1APC。一個(gè)細(xì)胞 首先通過(guò)紅色激光束，幾微秒后通過(guò)藍(lán)色激光束。247。它們?cè)陲@示上有三種形式 (見(jiàn)圖 6)： 激活 ： 外框呈灰色。 FITC主要出現(xiàn)在 FL1探測(cè)器上，但也有 部分重疊到 FL2探測(cè)器上。當(dāng)電壓上升時(shí)，信號(hào)增加，數(shù)據(jù)出現(xiàn)在道值較高處。 它將用 于調(diào)節(jié) FSC、 SSC、 FSC閾值、設(shè)淋巴細(xì)胞 region、確認(rèn)FL1/FL2/FL3/FL4的設(shè)置及象限設(shè)置。 注意：實(shí)驗(yàn)文件和它的數(shù)據(jù)文件之間存在一定限制。 8. 象限 marker：點(diǎn)擊，可在點(diǎn)圖、密度圖和等高圖上定位 marker 。 獲取 即收集并儲(chǔ)存流式細(xì)胞儀上數(shù)據(jù)的過(guò)程。 工具板按鈕 (見(jiàn)圖 1) BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊(cè) 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 2 1. 等高圖：點(diǎn)擊，可畫(huà)等高圖，可自定義圖的大小。 CellQuest 的文件： FCS list mode數(shù)據(jù)文件 ：是流式細(xì)胞儀的標(biāo)準(zhǔn)格式數(shù)據(jù)文件（ ）。一個(gè)實(shí)驗(yàn)文件可含上述 3種圖的組合，但獲取圖不能用來(lái)分析，分析圖不能用來(lái)獲取。 (見(jiàn)圖 2) BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊(cè) 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 4 E00：將信號(hào)放大 1(100)倍。每次只能有一個(gè)參數(shù)設(shè)置閾值 (FSC、 SSC、 FL FL FL3)。 Standby時(shí)儀器的激光器電源降低。若需全選，可從 Edit 菜單中選擇select all。 在進(jìn)行 3色或 4色獲取時(shí)依下列程序進(jìn)行： 開(kāi)儀器后開(kāi)計(jì)算機(jī)，以確保儀器和計(jì)算機(jī)之間的正常通訊。 優(yōu)化： 在此練習(xí)中，您將： ? 建立 CellQuest 實(shí)驗(yàn)文件。出現(xiàn)點(diǎn)圖對(duì)話框。 5． 6． 4 調(diào)節(jié) FSC/SSC 探測(cè)器（電壓）及 FSC 閾值 在 FSC/SSC點(diǎn)圖上調(diào)節(jié) FSC放大器增益和 SSC電壓是為了將所感興趣的細(xì)胞顯示在圖中。 1．選擇點(diǎn)圖 2．在出現(xiàn)的對(duì)話框內(nèi)選擇 X軸： FL1， Y軸： FL2 3．選擇 G1=R1 4．點(diǎn)擊 OK， FL1/FL2的點(diǎn)圖出現(xiàn) 5． 點(diǎn)擊 FL1/FL2點(diǎn)圖的邊框并將之拖至 FSC/SSC圖的右側(cè) 6．同樣建立一個(gè) FL3/FL2的點(diǎn)圖，并選擇 G1=R1。若 3色樣本，必要時(shí)需調(diào)節(jié) FL2%FL1， FL1%FL2，F(xiàn)L3%FL2， FL2%FL3的補(bǔ)償。 11．查看 FL4%FL3的補(bǔ)償，應(yīng)為 %,若必要，調(diào)節(jié)該補(bǔ)償。只有被選參數(shù)才儲(chǔ)存在 Data file中。此前已用樣本細(xì)胞優(yōu)化過(guò)條件，獲取和儲(chǔ)存的門(mén)及顆粒數(shù)已設(shè)定、文件的儲(chǔ)存已設(shè)定。出現(xiàn) Instrument Setting窗口。 若分析 3色數(shù)據(jù)，跳至 , 若分析 4色 , 請(qǐng)參見(jiàn) BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊(cè) 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 21 5． 11． 3 分析四色 1. File菜單下的選擇文件大小 ,文件大小對(duì)話框出現(xiàn)。 5． 11. 8 將統(tǒng)計(jì)改為電子表格 將在分析中儲(chǔ)存的輸出文件改為電子表格。從 Gate 菜單中選擇 Stop Edit Region即可停止。 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊(cè) 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 25 2．為將 嗜堿粒細(xì)胞群落顯示銹色，在 Gate list中將 G5移至首位。 12．從 Stats菜單選擇 Histogram Stats（直方圖 統(tǒng)計(jì)），注意 M2統(tǒng)計(jì)結(jié)果。 更改 Gate list 中門(mén)的次序： 門(mén)內(nèi)細(xì)胞群的顏色是依 Gate list中的門(mén)的次序而定，可更改 Gate list的次序，而改變門(mén)內(nèi)細(xì)胞群的顏色。在 Region邊界上 雙擊，或在 Region邊界上點(diǎn)擊一次、然后從 Gate 菜單中選擇 Edit Ploygon。 4．關(guān)閉 info 窗口。該點(diǎn)圖分為 4個(gè)象限， UL：左上，僅 FL2+ UR：右上， FL1+和 FL2+ LL：左下， FL1和 FL2 LR：右下，僅 FL2+ 在小鼠 IgG1FITC/小鼠 IgG1PE（同型對(duì)照）的 FL1H/FL2H點(diǎn)圖上，幾乎所有的細(xì)胞應(yīng)在 LL象限。 3．在 Instrument Setting窗口中點(diǎn)擊 Done。點(diǎn)擊 OK 7．可在 Parameter Description對(duì)話框中選擇剛剛編輯的試劑 Panel。然后數(shù)據(jù)按 Collection Criteria 窗口中的設(shè)置處理。 10．查看 FL2%FL3的補(bǔ)償，應(yīng)為 %,若必要，調(diào)節(jié)該補(bǔ)償。 17．移去同型對(duì)照管。特定抗體 Fab端與細(xì)胞表面上特定抗原的特異結(jié)合所發(fā)的熒光為陽(yáng)性熒光。將其拖至空白區(qū)。 6. 從工具板中選擇點(diǎn)圖：點(diǎn)擊工具板中點(diǎn)圖圖標(biāo)。當(dāng)打印對(duì)話框出現(xiàn)時(shí)，點(diǎn)擊 OK。 3色：用 FACSComp進(jìn)行 PMTs設(shè)置、補(bǔ)償調(diào)節(jié)、敏感度測(cè)試。任何命令可 影響被選擇的圖。 測(cè)試脈沖： 在 FACSCalibur中可從 status菜單中選擇 FSC(僅 FSC探測(cè)器上產(chǎn)生的信號(hào) )或ALL(所有探測(cè)器上產(chǎn)生的信號(hào) )或 OFF。 對(duì)數(shù)常用 于 分開(kāi)陰性信號(hào)和弱陽(yáng)性信號(hào)。 光電二極管用于探測(cè) FSC，因?yàn)?FSC是強(qiáng)信號(hào)。 ? 實(shí)驗(yàn)文件可轉(zhuǎn)化為文具薄。 16. 文本：點(diǎn)擊，然后點(diǎn)擊定位插入點(diǎn)并編輯文字。 工具板 工具欄可用來(lái)畫(huà)圖、 region, marker和文字等。 分析 將獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析。 10. 放大：點(diǎn)擊，然后點(diǎn)擊圖，將縮小圖放大到原大小。若二者聯(lián)系喪失，需將丟失的數(shù)據(jù)文件放在其實(shí)驗(yàn)文件同一目錄，實(shí)驗(yàn)文件才能找到其數(shù)據(jù)文件。 調(diào)節(jié)探測(cè)器和放大器可使所需信號(hào)出現(xiàn)在數(shù)據(jù)圖的適當(dāng)位置。 (見(jiàn)圖 2) 放大器 ： 可對(duì)信號(hào)進(jìn)行微調(diào)。 補(bǔ)償調(diào)節(jié)如下： FL2－％ FL1： 從 FL2探測(cè)器上減去重疊的 FL1 FL1－％ FL2： 從 FL1探測(cè)器上減去重疊的 FL2 FL3－％ FL2： 從 FL3探測(cè)器上減去重疊的 FL2 FL2－％ FL3： 從 FL2探測(cè)器上減去重疊的 FL3 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊(cè) 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 5 補(bǔ)償調(diào)節(jié)量依賴于探測(cè)器的電壓。每次只能激活一個(gè)圖。 ? 在獲取中，設(shè)定數(shù)據(jù)收集和儲(chǔ)存。 FL3和 FL4經(jīng)不同PMTs探測(cè)。 1. 先開(kāi)儀器后開(kāi)計(jì)算機(jī)，以確保儀器和計(jì)算機(jī)之間的正常通訊。 13. 從 Cytometer菜單中選擇 Detectors/Amps。若必要，將這群細(xì)胞調(diào)在所有圖的左下角。 12．插上同型對(duì)照管 13．點(diǎn)擊 Aqusition Control窗口中的 Restart。 4．若必要，調(diào) 節(jié) FL2%FL1使 FITC+細(xì)胞在 FL1/FL2點(diǎn)圖的右下象限。 Storage 窗口 在此窗口可設(shè)定獲取和儲(chǔ)存的顆粒數(shù)及類(lèi)型。 輸入：在 P1后的空格中輸入?yún)?shù)名。 5． 9 儲(chǔ)存、恢復(fù) 儀器設(shè)置