【正文】 ?化學方法 難度大，很少有使用 Mutagenesis:Why Mutate? Native proteins are not well suited for industrial application Native proteins are not optimized for medicinal purposes ?Increase the efficiency of enzymecatalyzed reactions ?Eliminate the need for cofactor in enzymatic reaction ?Change substrate binding site to increase specificity ?Change the thermal tolerance ?Change the pH stability ?Increase proteins resistance to proteases (purification) ?Signal sequences – secretion ?rare codon changes 工程二硫鍵 增加蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水性 酶表面親水化 抗氧化失活 Asn脫酰胺失活 定點突變技術（ sitedirected mutagenesis) ?1990年 Goodson將干擾素的 Thr3替換為 Cys3，并通過PEG修飾，水溶性增加，半衰期延長 (工程二硫鍵 ) ?噬菌體 T4溶菌酶 Ile3突變?yōu)?Cys3，使與 Cys97形成二硫鍵，催化活性不變，但熱穩(wěn)定性顯著提高 (工程二硫鍵 ) ?xylanase(工程二硫鍵 ) used to treat wood pulp in paper production needs to function at high temp ?Glu49位于色氨酸合成酶的疏水核心部分。 C 95176。 ① 提高酶活性 。 . 酶分子修飾的目的 基礎酶學的研究和疾病治療 醫(yī)療用酶的要求 穩(wěn)定性高 純度高 無免疫原性 基礎酶學研究上 (1)探測酶活性必需氨基酸的性質(zhì)和數(shù)目。 ?抗體保護的酶還有抗氧化酶 、 抗有機溶劑 、 抗低pH、 抗自溶 、 抗蛋白酶等作用 。 PEG: HOCH2CH2(OCH2CH2)nCH2CH2OH OC O(C H 2 ) 2 C OO NOOPEGNH2Prt O C O ( C H 2 ) 2 C O P E G NH P r t[NH + ] R 2R 1R 1OC OOC OH O H2C( C H O H )4C ON H+EPEG binds 23 water molecules per repeat unit PEG/water ‘shield’ can reduce activity of protein, but generally the increased circulation time makes up for this ?重組白介素（ rIL2）用大分子 PEG修飾后，半衰期延長 10倍 ?腺苷脫氨酶（ ADA） 用于治療聯(lián)合免疫缺陷 PEG修飾的 ADA在體內(nèi)的半衰期從數(shù)分鐘延長到 24小 時，免疫原性降低 1990年美國食品和藥品管理局（ FDA）批準用于聯(lián)合免疫缺陷的治療 ?天冬酰胺酶（ ASP） 用于白血病的治療 PEG修飾后半衰期從 24小時增加到 357小時 FDA1994年批準用于急性淋巴細胞性白血病治療 ?IFNα –2a PEG修飾后療效增加 FDA已批準正式生產(chǎn)，如 Roche公司的 PEGASYSTM PegInterferon2a Pegasys174。n t (hours) 100 20 40 powder W/O O C O ( C H 2 ) 2 C O P E G NH P r tETwophases transgalactosilation ROH Gal OR Organic phase EE: ?galactosidase Glu Aqueous phase EGal?1,4Glu (lactose) conversi243。 ?日本學者將聚乙二醇連到脂肪酶 、 胰凝乳蛋白酶上所得產(chǎn)物溶于有機溶劑 ， 在有機溶劑