【正文】 以池代窯 ， 改人工翻曲為機械通風、自動控溫的辦法 , 使紅曲的生產(chǎn)達到機械化、純種化 ， 生產(chǎn)周期從原來的 7d縮短到 5d。印紅等 [14]在空間飛行對紅曲霉菌產(chǎn)量的影響上做了嘗試，利用神舟三號返回艙搭載紅曲霉菌，獲得了高產(chǎn) Monacolin的菌株。目前 ， 提高紅曲色素色價的途徑主要有 : 提高紅曲菌的生物量、添加促進色素形成的物質(zhì)等 ， 具體措施有 ： 菌種誘變、固定化細胞技術(shù) 、 葡萄糖流加培養(yǎng)、菌種聯(lián)合培養(yǎng)、添加抗氧化劑和金屬離子、添加植物油、青霉素以及使用超聲波處理等。紅曲色素符合食品著色劑“天然、營養(yǎng)、多功能”的發(fā)展方向 ， 具有很好的應(yīng)用前景。 色價分析方法 液態(tài)發(fā)酵樣品用濾紙過濾得濾液和濾渣，濾液經(jīng)適當稀釋后用 721型分光光度計于510 nm處測定 OD值，濾渣用蒸餾水洗滌 3次后于 60℃ 烘干稱重測得生物量，然后稱取 1g干菌絲用 75%的乙醇浸提 2次，每次 2h，過濾，合并后的濾液適當稀釋后用 721型分光光度計于 510 nm處測定 OD值。 搖瓶篩選 （ 1）小瓶發(fā)酵初篩：斜面培養(yǎng) 5d~7d，待孢子成熟，接種于裝有 20mL發(fā)酵培養(yǎng)基的 250mL三角瓶中， 220r/min、 32℃培養(yǎng) 96 h。 菌種保藏的方法有：斜面冰箱保藏法、 砂 土管保藏法、菌絲速凍法 、石蠟油封存法、中北大學(xué) 20xx 屆畢業(yè)設(shè)計說明書 第 7 頁 共 25 頁 真空冷凍干燥保藏法、液氮超低溫保藏法。 培養(yǎng)基的設(shè)計 碳源 碳源是發(fā)酵培養(yǎng)基中最重要的組分之一，是微生物代謝的能量來源。工業(yè)生產(chǎn)中通常使用的氮源有氨、銨鹽中北大學(xué) 20xx 屆畢業(yè)設(shè)計說明書 第 8 頁 共 25 頁 和尿素。 無機鹽及微量元素 無機鹽類是微生物必不可少的一類物質(zhì)，它們?yōu)槲⑸锏恼４x提供多種重要的生理功能。 射線滅菌：紫外線的穿透力低，所以僅用于表面消毒和空氣的消毒。 過濾除菌： 除菌原理是利用微生物不能透過濾膜除菌。 分批滅菌 是將先配制好的培養(yǎng)基放在發(fā)酵罐或其他容器中，通入蒸汽將培養(yǎng)基和所用設(shè)備一中北大學(xué) 20xx 屆畢業(yè)設(shè)計說明書 第 10 頁 共 25 頁 起滅菌的操作過程（適用于小型發(fā)酵罐）。根據(jù)國家藥品質(zhì)量管理規(guī)范的要求，生物制品、藥品的生產(chǎn)場地業(yè)需要符合空氣潔凈度的要求 [8]。滅菌完畢，關(guān)閉蒸氣后，待管內(nèi)壓力低于空氣過濾器時，通入無菌空氣保壓 。經(jīng)質(zhì)檢合格可移種至發(fā)酵罐 (或冷卻至 10℃ 備用 )。降低流加碳源的速度，會降低菌體的比生長速度，溶氧會隨之提高，即溶氧值與碳源流加速度呈反相關(guān)。1 .4)U/mL 、 (177。這說明補加蛋白胨能顯著地促進紅曲霉的菌體生長。之后開始添加補料培養(yǎng)基，流速 20mL/h。紅曲色素 70%~80%存在于菌體內(nèi)， 20~30%分泌到發(fā)酵液中，存在于發(fā)酵液中的色素即胞外色素多為水溶性色素，菌體內(nèi)的色素即胞內(nèi)色素多為醇溶性色素，菌體內(nèi)紅曲色素的提取效果好壞直接關(guān)系到紅曲色素提取效率的高低，目前菌體內(nèi)紅曲色素的提取主要采用傳統(tǒng)乙醇浸提法。精制液經(jīng)置于塔頂部的高速離心霧化器，霧化成極細微的霧狀液珠，空氣經(jīng)過過濾和加熱，進中北大學(xué) 20xx 屆畢業(yè)設(shè)計說明書 第 17 頁 共 25 頁 入干燥器頂部空氣分配器，熱空氣呈螺旋狀均勻地進入干燥室。 而清理發(fā)酵罐需要 1d。90%=2603t 預(yù)處理之前的混合液的質(zhì)量為： 2603247。389%=8057kg 400m3 發(fā)酵罐的 豆餅粉 用量： 30421000247。由于乳糖的市場價高于葡萄糖，而乳糖發(fā)酵生產(chǎn)紅曲色素的能力與葡萄糖相比，差異并不顯著，因此碳源我們最終選擇了 7%的葡萄糖；在無機氮源和有機氮源中， NaNO3和蛋白胨累積紅曲色素 的產(chǎn)量最高，因此我們分別選擇 NaNO3作為無機氮源，蛋白胨為有機氮源進行設(shè)計；由于過高的無機離子濃度抑制了菌體的生長，使菌體不能大量生長繁殖而影響了紅曲色素的合成，因此無機離子濃度不易過高。 本工藝采用 32℃左右的發(fā)酵溫度，該發(fā)酵罐可以自動控制溫度在設(shè)定值。發(fā)酵罐內(nèi)徑為 。勢必加快 紅曲色素 在更多領(lǐng)域的應(yīng)用。而氧在水中的溶存量是微量的，在 20℃下，僅能溶解 ，據(jù) Finn[26]的報道，該值僅能滿足一般濃度的菌體生存 15min，因此發(fā)酵過程中，隨著氧被菌體不斷利用，要連續(xù)通入無菌空氣，氧由氣相溶解到液相，然后經(jīng)過液流傳給細胞壁進入細胞體內(nèi)，以維持菌的生長和目的產(chǎn)物的合成。 利用紅曲霉發(fā)酵紅曲色素， pH值對紅曲色素尤其重要，因為它直接影響紅曲色素合成酶的酶促反應(yīng)。38%=179kg 400m3 發(fā)酵罐的 KH2P04 用量： 34021000247。85%=3402t 也就是一批次發(fā)酵完畢后發(fā)酵液的總量。每次的生產(chǎn)任務(wù)是 909 噸 紅曲色素 。成品連續(xù)地由干燥塔底部和旋風分離器中輸出，廢氣由引風機排空，最后得到成品 [30]。 預(yù)處理收率在 89%~93%。補料階段持續(xù)約 50h。)U/mL，顯著高于不補加蛋白胨條件下所得的紅曲色素色階 (177。)U/mL 和(177。 補料工藝的控制 補料一般是在發(fā)酵進行至大量生成產(chǎn)物的階段 ， 因合成產(chǎn)物和維持細胞活動的需要 ,有選擇地補充營養(yǎng)物質(zhì)。 中北大學(xué) 20xx 屆畢業(yè)設(shè)計說明書 第 13 頁 共 25 頁 6 發(fā)酵控制 pH 值的控制 紅曲霉的最適生長 pH為 ~，初步確定紅曲霉 生長階段 pH控制在 。 斜面培養(yǎng) 菌種的斜面培養(yǎng)必須有利于菌種的生長而不產(chǎn)酸，并要求斜面菌種絕 對純，不得混有任何雜菌和噬菌體，培養(yǎng)條件應(yīng)有利于菌種繁殖，培養(yǎng)基以多含有機氮而不含或少含糖為原則。后者主要原理為： （ 1） 慣性滯留作用 （ 2） 攔截滯留作用 （ 3） 布朗擴散作用（ 4） 重力沉降 （ 5） 靜電作用。然后進入維持罐（或維持管），使在滅菌溫度下維持 5~7 分鐘后再進入冷卻管，使其冷卻至接種溫度 并直接進入已事先滅菌（空罐滅菌）過的 發(fā)酵罐 內(nèi)。 儀器滅菌 在發(fā)酵操作過程中，種子活化、擴大培養(yǎng)需要接種環(huán)、搖瓶、試管等儀器。水煮常壓滅菌： 100℃ 。因此，磷酸二氫鉀，硫酸鎂對紅曲色素的合成具有顯著的促進作用。常用的氮源有有機氮源和無機氮源兩大類。但是因為大米粉市場價格明顯低于葡萄糖價格，兩者差距不大，因此，宜選用大米粉作為紅曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源。 3 培養(yǎng)基 紅曲霉 的培養(yǎng)基 A：斜面培養(yǎng)基：可溶性淀粉 3%，葡萄糖 6%，蛋白胨 2%，瓊脂 3%，自來水，乳酸調(diào)節(jié) pH值至 ， 121℃ 高壓滅菌 30 min。根據(jù)生物量高的 5~8株用于復(fù)篩和菌種保藏。 誘變選育 選育過程： 復(fù)合誘變流程：出發(fā)菌株→超聲波誘變→平板分離→紫外誘變→平板分離→穩(wěn)定性試驗→對比試驗 孢子懸浮液的制備： 菌株在 33℃ 斜面培養(yǎng) 4d后，用無菌生理鹽水洗下紅曲霉孢子，倒入 已滅菌的裝有 20~30顆玻璃珠的三角瓶中，放入搖床中 220r/min 振蕩 1h，孢子分散均勻即可。 菌種描述 紅曲霉 在 麥芽 汁瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，菌落初為白色，老熟后變成 淡粉色、紫色或灰黑色。 Silvana等 [19]以葡萄皮籽為原料 ， 研究確定了液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲色素的工藝條件。 國外研究現(xiàn)狀 有關(guān)紅曲色素的現(xiàn)代研究日本起步較早 ， 從 1890年便開始對其進行分離研究 ， 20世紀 30年代紅曲色素傳到了歐美 ， 之后各國相繼開始了對紅曲菌的分類鑒定、紅曲色素發(fā)酵提取工藝及生產(chǎn)應(yīng)用等方面的研究 ， 對其組分分離、結(jié)構(gòu)鑒定及代謝機制等方面也開展了一些工作 ， 但研究進展緩慢 。 黃前美等 [10]用紅曲霉 3532菌種 ， 以價格低廉的馬鈴薯、造紙工業(yè)廢棄物甘蔗渣和生產(chǎn)特級面粉的副產(chǎn)物普副粉為原料 ， 添加適量的無機氮源以代替大米 ,進行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲色素 , 色素產(chǎn)量可提高 10%。初級代謝主要產(chǎn)生不飽和脂肪酸、醇、酯等芳香化合物 ， 次級代謝的產(chǎn)物主要有紅曲色素、 Monacolin K、降血脂藥物 氨基丁酸、桔霉素 (Citrinin)、天然抗氧化劑黃酮酚等。無法滿足功能性紅曲全程無菌的工藝條件 [2]。動物性試驗表明，使用紅曲色素及其制品的食物均未發(fā)現(xiàn)急、慢性中毒現(xiàn)象，也無致突變作用。 本設(shè)計 以 從土壤中篩選的 紅曲霉為出發(fā)菌株，通過 紫外線超聲波復(fù)合 誘變選育 出 紅曲色素高產(chǎn)菌株 ， 通過搖瓶篩選和穩(wěn)定性試驗，得到穩(wěn)定性高產(chǎn)紅曲色素的突變菌株。近年來，隨著國內(nèi)外學(xué)者對紅曲色素研究的深入，其應(yīng)用范圍也在不斷擴大。此工藝自動化程度高，污染小，色素粉色價高，但設(shè)備投資大，生產(chǎn)成本高，且規(guī)模小，另外該工藝只能生產(chǎn)紅曲紅色素。使用不同的紅曲菌株、培養(yǎng)基、發(fā)酵條件所產(chǎn)生的紅曲色素組成有較大差異 ,因而其生成途徑也有不同。菌種產(chǎn)色水平較低、色素生產(chǎn)成本較高是紅曲色素目前還不能在 食品中廣泛使用的主要原因之一。液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的紅曲色素 ,主要成分是水溶性的“復(fù)合色素”。而且紅曲色素無毒性、無致突變作用 ， 安全性很高。能利用淀粉、糊精、麥芽糖、蜜二糖、纖維二糖、葡萄糖、甘油、乙醇、乳酸、蘋果酸、檸檬酸等多種糖類和酸類作為碳源，能利用硝基氮、氨基氮和有機氮。將所得孢子懸液稀釋 l06倍涂布， 32℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3d后觀測、計數(shù)，對誘變后的菌株進行篩選。根據(jù)提 取紅曲色素 產(chǎn)量高篩選出 1~2株用于下一輪誘變處理 [22]。 D： 補料培養(yǎng)基： 補料 1： 25%~28%氨水，使 pH保持在設(shè)定范圍內(nèi)。雖然補加麥芽糖得到的紅曲色素色階高于補加葡萄糖的方案，但是二者之問無差異顯著性。 氮是構(gòu)成微生物細胞蛋白質(zhì)和核酸的主要元素，因此是菌體生長以及代謝產(chǎn)物形成所必需的。 常用的滅菌方法有以下幾種： a、化學(xué)滅菌； b、射線滅菌； c、干熱滅菌； d、濕熱滅菌； e、過濾滅菌。 干熱滅菌： 滅菌原理是利用高溫對微生物有氧化、蛋白質(zhì)變性和電解質(zhì)濃縮作用而殺滅微生物。 培養(yǎng)基滅菌 對于培養(yǎng)基滅菌大多采用濕熱滅菌，即利用飽和水蒸氣有很強的穿透力，而且在冷凝時放出大量冷凝熱，很容易使蛋白質(zhì)凝固而殺滅各種微生物。加熱時間短，提高了熱的利用率；操作條件恒定，滅菌質(zhì)量穩(wěn)定；易于實現(xiàn)管道化和自控操作；發(fā)酵設(shè)備利用率高。特點是采用了高效率 的前置過濾設(shè)備，使空氣經(jīng)過多次過濾，因而所得的空氣無菌程度比較高。 一級種子質(zhì)量要求： 種齡： 12h pH 值： 5177。由于紅曲紅曲霉酶活性對溫度的變化極為敏感，太高或太低都會影響其合成紅曲色素的能力，紅曲霉 發(fā)酵一般溫度控制在 30℃左右 ，在搖瓶發(fā)酵實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，本工藝采用 28℃ ~30℃ 的發(fā)酵溫度，該發(fā)酵罐可以自動控制溫度在設(shè)定值。 本設(shè)計補充菌體所需能源為葡萄糖，有機氮源為蛋白胨，無機氮源為 NaNO3 和氨水，無機鹽和微量元素為 KH2P0 MgS04 等。但是隨著葡萄糖補加濃度進一步增大，最終紅曲色素色階呈現(xiàn)下降趨勢。其原因可能是在發(fā)酵過程 中 蛋白胨能明顯促進紅曲霉的菌體生長，但是會對紅曲色素的合成產(chǎn)生一定的負作用，尤其是補加濃度過高會顯著降低紅曲色素的合成。當發(fā)酵約 90h時，產(chǎn)物紅曲色素含量達到最高的 300g/L。為節(jié)約成本，本設(shè)計采用較低濃度乙醇升高 pH 來溶出紅曲色素。 中北大學(xué) 20xx 屆畢業(yè)設(shè)計說明書 第 18 頁 共 25 頁 8 物料衡算 發(fā)酵罐數(shù)量衡算 本設(shè)計是年產(chǎn) 3 萬噸 的 紅曲色素 的工藝設(shè)計 。96%=947 t 醇溶性紅曲色素所占比例為： 94780%=758t 水溶性紅曲色素所占比例： 94720%=189t 醇溶性紅曲色素用乙醇抽提前的質(zhì)量： 758247。= 本設(shè)計采用的是 400m3 的發(fā)酵罐，故發(fā)酵罐的個數(shù)為： 247。 中北大學(xué) 20xx 屆畢業(yè)設(shè)計說明書 第 21 頁 共 25 頁 9 結(jié)果與討論 （ 1） 本設(shè)計利用 從土壤中篩選的紅曲霉菌株 ，經(jīng)過紫外線誘變和 超聲波復(fù)合誘變 ，得到的高產(chǎn)紅曲色素的正向突變菌株。補料與補料完畢后控制在 ，使紅曲色素能夠更好的積累。 中北大學(xué) 20xx 屆畢業(yè)設(shè)計說明書 第 22 頁 共 25 頁 （ 4）下游加工工藝的優(yōu)化 紅曲色素分為水溶性和醇溶性兩種，發(fā)酵完畢后水溶性紅曲色素為胞外色素，占總發(fā)酵色素的 20%左右，菌絲體內(nèi)的為醇溶性色素，水溶性色素需要經(jīng)過板框壓濾和離心收集濾液，醇溶性需要用 70%~80%的乙醇進行多次抽提，提取完畢后將兩種濾液混合，對酒精進行回收，然后進行噴霧干燥，最后得到干燥粉末狀的紅曲色素