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血紅蛋白的提取和分離(第1課時)(更新版)

2025-09-24 01:36上一頁面

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【正文】 這使血紅蛋白的分離過程非常直觀,大大簡化了實驗操作。 如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡,輕輕敲打柱體以消除氣泡,消除不了時要重新裝柱。貼壁加樣。 ②滴加透析樣品: 吸管吸 1ml樣品加到色譜柱的頂端,滴加樣品時,吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣,同時注意不要破壞凝膠面。 ③ 凝膠色譜柱的裝填方法: A、固定:將色譜柱裝置固定在支架上。 注意事項 :底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面,否則難以鋪實尼龍網(wǎng),還會導致液體殘留,蛋白質(zhì)分離不徹底。 (2)血紅蛋白的釋放: 加蒸餾水到 原血液體積 , 再加40%體積的 甲苯 ,置于 磁力攪拌器 上充分攪拌 10分鐘(加速細胞破裂) ,細胞破裂釋放出血紅蛋白。 市場上有高分子量、次高分子量及低分子量的標準蛋白試劑出售。聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑 N,N’ 亞甲基雙丙烯酰胺在 引發(fā)劑 和 催化劑 的作用下聚合交聯(lián)成的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。 : : 通常由 1- 2 種緩沖劑 溶解于水 中配制而成。血紅蛋白 兩個 α -肽鏈 兩個 β 一肽鏈 四個亞鐵 血 紅素基團 每個肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素基團, 此基團可攜帶一分子氧或一分子二 氧化碳,血紅蛋白因含有血紅素而 呈紅色。 能夠抵制外界的酸和堿對溶液 PH值的影響, 維持 PH基本不變。 電泳檢測結(jié)果 瓊脂糖凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳 在測定蛋白質(zhì)分子量時常用 十二烷基硫酸鈉( SDS) — 聚丙烯酰胺凝膠電泳。 3. SDS作用機理 : 用 SDS測定蛋白質(zhì)分子量的方法 使用 SDS— 聚丙烯酰胺凝膠電泳 測定蛋白質(zhì)的分子量時,可選用一組 已知分子量的標準蛋白 同時進行電泳,根據(jù)已知分子量的標準蛋白的 電泳區(qū)帶位置 ,可以測定 未知蛋白質(zhì) 的分子量。 低速離心(低速短時間)重復 5步驟三次,直至上清液中已沒有黃色,表明洗滌干凈。 ②底塞的制作: 打孔 → 挖出凹穴 → 安裝移液管頭部 → 覆蓋尼龍網(wǎng),再用 100目尼龍紗包好,插到玻璃管的 一 端 。 ② 凝膠的前處理: 配置凝膠懸浮液:計算并稱取一定量的凝膠 ,浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后,配成凝膠懸浮液。 ( 3)樣品加入與洗脫 ① 調(diào)節(jié)緩沖液面: 打開下端出口,使 柱內(nèi)緩沖液 緩慢下降到與凝膠面平齊 ,關(guān)閉出口。 ( 3)樣品加入與洗脫 注意: 正確的加樣操作是: 不要觸及并破壞凝膠面。如果色帶均勻、狹窄、平整,說明凝膠色譜柱的性能良好。
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