血紅蛋白的提取和分離(第1課時(shí))(更新版)
【正文】 這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作。 如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時(shí)要重新裝柱。貼壁加樣。 ②滴加透析樣品： 吸管吸 1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣，同時(shí)注意不要破壞凝膠面。 ③ 凝膠色譜柱的裝填方法： A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。 注意事項(xiàng) ：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會(huì)導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。 (2)血紅蛋白的釋放： 加蒸餾水到 原血液體積 ， 再加40％體積的 甲苯 ，置于 磁力攪拌器 上充分?jǐn)嚢?10分鐘（加速細(xì)胞破裂） ,細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。 市場(chǎng)上有高分子量、次高分子量及低分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑出售。聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑 N,N’ 亞甲基雙丙烯酰胺在 引發(fā)劑 和 催化劑 的作用下聚合交聯(lián)成的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。 : : 通常由 1－ 2 種緩沖劑 溶解于水 中配制而成。血紅蛋白 兩個(gè) α －肽鏈 兩個(gè) β 一肽鏈 四個(gè)亞鐵 血 紅素基團(tuán) 每個(gè)肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)， 此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二 氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而 呈紅色。 能夠抵制外界的酸和堿對(duì)溶液 PH值的影響， 維持 PH基本不變。 電泳檢測(cè)結(jié)果 瓊脂糖凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳 在測(cè)定蛋白質(zhì)分子量時(shí)常用 十二烷基硫酸鈉（ SDS） — 聚丙烯酰胺凝膠電泳。 3. SDS作用機(jī)理 : 用 SDS測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的方法 使用 SDS— 聚丙烯酰胺凝膠電泳 測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量時(shí)，可選用一組 已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白 同時(shí)進(jìn)行電泳，根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的 電泳區(qū)帶位置 ，可以測(cè)定 未知蛋白質(zhì) 的分子量。 低速離心（低速短時(shí)間）重復(fù) 5步驟三次，直至上清液中已沒有黃色，表明洗滌干凈。 ②底塞的制作： 打孔 → 挖出凹穴 → 安裝移液管頭部 → 覆蓋尼龍網(wǎng)，再用 100目尼龍紗包好，插到玻璃管的 一 端 。 ② 凝膠的前處理： 配置凝膠懸浮液：計(jì)算并稱取一定量的凝膠 ,浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。 （ 3）樣品加入與洗脫 ① 調(diào)節(jié)緩沖液面： 打開下端出口，使 柱內(nèi)緩沖液 緩慢下降到與凝膠面平齊 ，關(guān)閉出口。 （ 3）樣品加入與洗脫 注意： 正確的加樣操作是： 不要觸及并破壞凝膠面。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。
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