【正文】 設(shè)定。 10．選擇 或 輸入 所有參數(shù)名 選擇：點擊右側(cè)的箭頭，選擇已設(shè)定的參數(shù)名。只有被選參數(shù)才儲存在 Data file中。 ? 設(shè)定文件儲存參數(shù) ? 創(chuàng)建試劑組合 5． 7． 1 設(shè)置 Acquisition amp。 11．查看 FL4%FL3的補(bǔ)償，應(yīng)為 %,若必要，調(diào)節(jié)該補(bǔ)償。 3．點擊 Aqusition Control窗口中的 Restart。若 3色樣本，必要時需調(diào)節(jié) FL2%FL1， FL1%FL2，F(xiàn)L3%FL2， FL2%FL3的補(bǔ)償。 11．在其余的圖上，重復(fù) 810步。 1．選擇點圖 2．在出現(xiàn)的對話框內(nèi)選擇 X軸： FL1， Y軸： FL2 3．選擇 G1=R1 4．點擊 OK， FL1/FL2的點圖出現(xiàn) 5． 點擊 FL1/FL2點圖的邊框并將之拖至 FSC/SSC圖的右側(cè) 6．同樣建立一個 FL3/FL2的點圖，并選擇 G1=R1。 5． 6． 6 調(diào)節(jié) FL FL FL3 的探測器（電壓） 在上同型對照管時，可能需基于門內(nèi)的淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié) FL FL FL3的探測器（電壓）。 5． 6． 4 調(diào)節(jié) FSC/SSC 探測器（電壓）及 FSC 閾值 在 FSC/SSC點圖上調(diào)節(jié) FSC放大器增益和 SSC電壓是為了將所感興趣的細(xì)胞顯示在圖中。將其拖至空白區(qū)。出現(xiàn)點圖對話框。 小鼠 IgG1FITC/小 鼠 IgG1PE/小鼠 IgG1PerCP/CD4APC。 優(yōu)化： 在此練習(xí)中，您將： ? 建立 CellQuest 實驗文件。紅色激發(fā)信號 (FL4)需延遲后才能與藍(lán)色激發(fā)信號 (FSC、 SSC、 FL FL FL3)同時到達(dá)電子分析部分。 在進(jìn)行 3色或 4色獲取時依下列程序進(jìn)行： 開儀器后開計算機(jī)，以確保儀器和計算機(jī)之間的正常通訊。 ? 編輯試劑目錄及組合，以便在獲取時使用。若需全選，可從 Edit 菜單中選擇select all。點擊除框以外的任何地方即可激活。 Standby時儀器的激光器電源降低。 PE主要出現(xiàn)在 FL2探測器上，但也有 部分重疊到 FL1和 FL3探 測器上。每次只能有一個參數(shù)設(shè)置閾值 (FSC、 SSC、 FL FL FL3)?？赏ㄟ^點擊 ?? 來選 擇或直接拖動滑標(biāo)上下移動。 (見圖 2) BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 4 E00：將信號放大 1(100)倍。調(diào)補(bǔ)償用對照包括單陽性熒光試劑和同型對照試劑，如：調(diào) FITC補(bǔ)償對照包括下列試劑： CD3－ FITC/小鼠 IgG1PE/小鼠 IgG1PerCP/小鼠IgG1APC。一個實驗文件可含上述 3種圖的組合，但獲取圖不能用來分析，分析圖不能用來獲取。若數(shù)據(jù)文件未改變目錄或被刪除，實驗文件可找到其數(shù)據(jù)文件。 CellQuest 的文件： FCS list mode數(shù)據(jù)文件 ：是流式細(xì)胞儀的標(biāo)準(zhǔn)格式數(shù)據(jù)文件（ ）。 9. 縮小：點擊，然后點擊圖，將放大圖縮小到原大小。 工具板按鈕 (見圖 1) BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 2 1. 等高圖：點擊，可畫等高圖，可自定義圖的大小。在獲取前，需用您的樣本來優(yōu)化儀器的條件。 獲取 即收集并儲存流式細(xì)胞儀上數(shù)據(jù)的過程。點擊選擇。 8. 象限 marker：點擊，可在點圖、密度圖和等高圖上定位 marker 。 17. 計算器：如果自動復(fù)計算關(guān)閉，點擊進(jìn)行數(shù)據(jù)復(fù)計算。 注意：實驗文件和它的數(shù)據(jù)文件之間存在一定限制。 ? 在實驗文件中，有 3種圖：獲取、分析和獲 取到分析。 它將用 于調(diào)節(jié) FSC、 SSC、 FSC閾值、設(shè)淋巴細(xì)胞 region、確認(rèn)FL1/FL2/FL3/FL4的設(shè)置及象限設(shè)置?？赏ㄟ^電壓而選擇對 FSC 信號 的不同放 大。當(dāng)電壓上升時，信號增加，數(shù)據(jù)出現(xiàn)在道值較高處。 閾 值 ： 可用來設(shè)置低于該道值的數(shù)據(jù)信號不被處理，只有高于或等于閾值道數(shù)的信號才傳送到計算機(jī)進(jìn)行處理。 FITC主要出現(xiàn)在 FL1探測器上，但也有 部分重疊到 FL2探測器上。 狀態(tài)： 顯示儀器運行模式 Not Ready: 激光器正在預(yù)熱、鞘液桶空、廢液桶滿 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 6 Ready: 樣本管插在 SIP上且支撐臂位于中位 (即管下 )，樣本管加壓，儀器在 RUN 狀態(tài) Standby: 儀器在 Standby 狀態(tài)或儀器在 Run 狀態(tài)而無樣本管在 SIP上或支撐臂位 于側(cè)位 (即不在管下 )或樣本管未完全 加壓。它們在顯示上有三種形式 (見圖 6)： 激活 ： 外框呈灰色?？赏ㄟ^下列 2種方式選擇多個圖：撳 Shift鍵同時點擊多個圖框或在實驗文件中點擊任何對角線拖框包繞欲選的圖。247。 4色：用 FACSComp進(jìn)行 PMTs設(shè)置、時間延遲校準(zhǔn)、補(bǔ)償調(diào)節(jié)、敏感度測試。一個細(xì)胞 首先通過紅色激光束，幾微秒后通過藍(lán)色激光束。將打印一份總結(jié)報告。 小鼠 IgG1FITC/小鼠 IgG1PE/CD45PerCP/小鼠 IgG1APC。 7. 在實驗文件的空白區(qū)點擊，然后拖動對角線至所需大小。出現(xiàn) Acqusition Control 對話框。 5． 6． 3 調(diào)出儲存的由 FACSComp 生成的儀器條件 1．從 Cytometer 菜單中選擇 Instrument Settings，出現(xiàn)對話框 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 11 2．點擊 Open，選擇目錄及文件（如： BD Files\ Calib File），點擊 Open 3．點擊 Set、點擊 Done。 3．移去同型對照管，點擊 Acqusition Control 窗口中的 Pause。 若必要，用同型對照管，在所有 熒光點圖上調(diào)節(jié) FL1/2/3的電壓來調(diào)節(jié)背景熒光。 10．從 Status窗口選擇 Quadrant Stas（象限統(tǒng)計）。 18． 關(guān)閉 Detector/Amps 和 Threshold窗口 5． 6． 7 調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償 優(yōu)化的最后一步是調(diào)節(jié)光譜重疊。 1．從 Cytometer 菜單中選擇 Compensation 2．插上 CD3FITC/小鼠 IgG1PE/小鼠 IgG1PerCP/小鼠 IgG1APC管。若作 3色，跳至 14 步。 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 14 5． 7 實驗練習(xí)： 3色 /4色預(yù)獲取 在此練習(xí)中，您將： ? 設(shè)定 Acquisition（獲?。┖? Storage（儲存）的條件。 3．在 Collection Criteria中選擇默認(rèn)設(shè)置： Event Count， 10000， All 可設(shè)置獲取終止的條件： Event Count：獲取的顆粒數(shù) Time：獲取時間 4．在 Storage Gate中選擇默認(rèn)設(shè)置： All 5．在 Resolution （分辨率）中選擇默認(rèn)設(shè)置： 1024 6．點擊 Parameter Saved，出現(xiàn)對話框 7．若無第二根激光器，不選 P6（ FLXA）、 P7（ FLXW）。 5．在 Custom Prefix中：輸入文件名 6．在 File Name Suffix中選擇 File Count 7．在 File Count 中：確認(rèn)輸入的為 1 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 16 8．點擊此對話框的 OK 9．在 Parameter Description對話框中輸入您想保存的 Patient ID， Sample ID， Comments等信息。 5． 8 實驗練習(xí)：數(shù)據(jù)獲取 在此練習(xí)中，將獲取數(shù)據(jù)。 9．使儀器處于 Standby狀態(tài)。 5． 9． 2 恢復(fù)儀器設(shè)置 1．從 Cytometer菜單中選擇 Instrument Setting。若二色分析，則需 6管。 3．若需要，可編輯象限統(tǒng)計的內(nèi)容，從 Status 菜單中選擇 Edit Quadrant Stats。 若 4色，從同型對照管的 FL1H/FL4H點圖上得出門內(nèi)細(xì)胞 %LL（左下象限）。 此時，文件圖標(biāo)變成文具簿圖標(biāo)，當(dāng)您打 開文具簿文件時，原文件不變，而生成一個備份。 5． 12． 1 設(shè)置 Region 1．選擇文件目錄及文件名 2．在工具板中選擇適當(dāng)形式的 Region，在 FSC/SSC點圖上將淋巴細(xì)胞圈上。點擊并拖動 Region的頂點即可。在 CellQuest 中，默認(rèn) G1=R1， G2=R2，但可以根據(jù)需要設(shè)定合適的門 。 1．在 FL3/SSC點圖上，在嗜堿粒細(xì)胞群上畫 R5，可見嗜堿粒細(xì)胞群呈紅色，即使 G5=R5的顏色是銹色，因為嗜堿粒細(xì)胞群落在 R1內(nèi)。 注意： 1. 限定邏輯門時，在 and 、 or、 region 之間需空格。