【正文】 arl amp。 ?親水性，對(duì)蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)吸附的不太牢，用較溫和的洗脫條件就可達(dá)到分離的目的，因此 不致引起生物大分子物質(zhì)的變性和失活。 缺點(diǎn)： 蛋白質(zhì)和層析基質(zhì)的結(jié)合強(qiáng)度相差并不很大 ，溶劑系統(tǒng)的改變又不可能過(guò)細(xì)過(guò)密同一個(gè)洗脫級(jí)分中就可能含有兩種或兩種以上的蛋白質(zhì)，達(dá)不到分離純化的目的。 后來(lái)無(wú)色物質(zhì)也可利用吸附柱層析分離。丙酮用量一般 10倍于蛋白質(zhì)溶液體積。 ? ⑨抽提外周膜蛋白時(shí)，必須用含有 EDTA的適當(dāng)緩沖液；抽提內(nèi)嵌膜蛋白時(shí)，必須用去污劑作增溶劑。 ? 水溶性的 清蛋白 (如：血清白蛋白、卵清蛋白等 )可以用水抽提； ? 不溶于水的鹽溶性 球蛋白 (如：血紅蛋白、肌紅蛋白等 )可以用稀中性鹽溶液 (如 )抽提； 三、抽提 ? 不溶于水和鹽溶液但可溶于稀堿溶液的 米谷蛋白和麥谷蛋白 ，可以用稀堿溶液抽提； ? 不溶于水和中性鹽溶液，但能溶于 70～ 80％乙醇溶液中的 醇溶蛋白 (如醇溶谷蛋白 )，可以用 70～80％乙醇溶液抽提； ? 脂蛋白 要用表面活性劑 (即洗滌劑 )才能抽提出來(lái)， ? 膜蛋白 往往用非離子型表面活性劑的稀溶液抽提。 二、細(xì)胞破碎 根據(jù)實(shí)驗(yàn)材料的性質(zhì)，選擇破碎方法 ? 肝、腦、腎、脾等軟組織，容易破碎，可以用勻漿器研磨； ? 肌肉不易破碎，可以先用絞肉機(jī)絞碎，然后用組織搗碎機(jī)粉碎； ? 紅血球，其細(xì)胞膜脆弱，可以用低滲透壓法破碎。 ? 攪拌要緩慢，防止泡沫表面張力引起蛋白質(zhì)變性。 ? 蛋白質(zhì)制劑必須達(dá)到較高純度才能進(jìn)行結(jié)晶。 ? 第二階段 (粗分級(jí) )： – 根據(jù)不同蛋白質(zhì)的溶解度差異，采用適當(dāng)?shù)某恋矸ǎ瑢?duì)所需蛋白質(zhì)進(jìn)行初步的分離提純。第三章 蛋白質(zhì)的分離 提純及檢測(cè) 第一節(jié) 引言 第二節(jié) 前處理 第三節(jié) 蛋白質(zhì)的粗分離 第四節(jié) 蛋白質(zhì)的層析分離 第五節(jié) 蛋白質(zhì)的電泳分離 第六節(jié) 蛋白質(zhì)的結(jié)晶 第七節(jié) 蛋白質(zhì)的檢測(cè) 第一節(jié) 引言 一、蛋白質(zhì)的存在 ? 蛋白質(zhì)存在于所有的生物細(xì)胞中，是構(gòu)成生物體最基本的結(jié)構(gòu)物質(zhì)和功能物質(zhì)。 胞外蛋白不須細(xì)胞破碎。 – 采用 結(jié)晶法 對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)一步提純。 ? 嚴(yán)格控制 pH值，防止過(guò)酸過(guò)堿對(duì)蛋白質(zhì)的變性作用。 一、材料的選擇 從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)取材時(shí)，要注意三點(diǎn)： ? (1)要注意動(dòng)物本身的生理特征； ? (2)要盡可能在接近正常狀態(tài)下取出器官或組織； ? (3)死后的變化要限制在最小限度內(nèi)，為此必須迅速取出器官或組織，充分脫血，立即使用，或放在 10℃ ～ 50℃ 的冷庫(kù)中凍存。 根據(jù)所需蛋白質(zhì)溶解性，采用適當(dāng)?shù)娜軇┏樘帷? ? ⑧對(duì)植物組織使用較高濃度的緩沖液作為抽提液，防止 植物細(xì)胞的 內(nèi)含物改變抽提液的 pH值 。 注意事項(xiàng)： 使用丙酮沉淀時(shí)，必須在 0～ 4℃下進(jìn)行。他將植物葉子的色素通過(guò)裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動(dòng)后形成不同的色帶而被分開(kāi)，由此得名為 “ 色譜法 ” 。 改善： 蠕動(dòng)泵或恒流泵 維持流速恒定的簡(jiǎn)易裝置 改變?nèi)軇┫到y(tǒng) ? 分級(jí)洗脫 在一個(gè)溶劑系統(tǒng)洗滌后，改用另一溶劑系統(tǒng)。 ?陽(yáng)離子交換劑 ：平衡離子帶正電的離子交換劑，能與帶正電的離子基團(tuán)發(fā)生交換作用 ?陰離子交換劑： 平衡離子帶負(fù)電的離子交換劑，與帶負(fù)電的離子基團(tuán)發(fā)生交換作用 pH值的影響 NH3 R COOH + NH3 R COO + R NH2 COO Low pH Positive charge High pH Negative charge Hydrogen gained Hydrogen lost 離子溶度影響 → 離子濃度增加 + 離子取代順序 （二）離子交換劑的基本類型 根據(jù)可供交換的離子性質(zhì)： ?陽(yáng)離子交換劑 ?陰離子交換劑 按解離基團(tuán)的解離 pH值： ?強(qiáng)酸型交換劑 ?強(qiáng)堿型交換劑 ?弱酸型交換劑 ?弱堿型交換劑 配基 結(jié)構(gòu) pK 分類 簡(jiǎn)稱 硫酸基 (sulphate) OSO3H 2 強(qiáng)酸 S 磺酸基 (sulphonate) (CH2) nSO3H 2 強(qiáng)酸 SM(n = 1) ， SE(n = 2) ， SP(n = 3) ， SB(n = 4) 磷酸基 (phosphate) OPO3H2 2和 6 中等酸性 P 羧酸基(carboxylate) (CH2) nCOOH 弱酸 CM(n = 1) 叔胺基 (tertiary amine) 2(CH2) nN+ H(C2H5)2 弱堿 DEAE(n = 2) 季胺基 (quaternary amine) 2(CH2) n2N+ ≡(R)3 9 強(qiáng)堿 Q ， QAE 離子交換劑的基質(zhì) 瓊脂糖 離子交換劑 離子交換 交聯(lián)葡聚糖 聚苯乙烯 離子交換 纖維素 離子交換纖維素 交換劑 名 稱（纖維素） 作 用 基 團(tuán) 特 點(diǎn) 陰離子 交換劑 二乙氨基乙基 DEAE+OC2H4N+(C2H5)2 最常用在 三乙氨基乙基 DEAE+OC2H4N+(C2H5)3 氨乙基 AE+OC2 H4NH2 胍乙基 強(qiáng)堿性、極高 pH仍有效 陽(yáng)離子 交換劑 羧甲基 CM— OCH2COO— 最常用在 pH4以上 磷酸 P－ O PO2－ 用于低 pH 磺甲基 SM－ OCH2SO3－ 磺乙基 SE－ OC2H4SO3－ 強(qiáng)酸性用于極低 pH 常用： DEAE纖維素（二乙基氨基纖維素） CM纖維素（羧甲基纖維素） 優(yōu)點(diǎn)： ?開(kāi)放性長(zhǎng)鏈和松散的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有較大的表面積，吸附容量大，通透性好，大分子可自由通過(guò)，使它的 實(shí)際交換容量要比離子交換樹脂大的多。 Dowex eg. Dowex 4100 陽(yáng)離子交換劑 Amberlite IRC amp。 層析柱的選擇 親和力相差不多而需要交換劑的體積較大 增加柱長(zhǎng)為宜，使待分離的組分被 洗脫后再結(jié)合于交換劑上的概率增加 ，柱的直徑與高度的比以1： 20左右為宜。 當(dāng)使用 陽(yáng)離子交換劑 時(shí)，增加鹽離子濃度，則升高 pH值 ?親和洗脫 目的蛋白與加入離子發(fā)生 特異性相互作用 而被 置換 ?添加置換劑 能 置換 基質(zhì)上 所有蛋白質(zhì) 洗脫方法 階段洗脫和梯度洗脫 洗脫速度 洗脫速度通常要保持 恒定 洗脫速度慢：分辨率高，但洗脫峰寬 洗脫速度快：洗脫峰窄，但分辨率下降 洗脫液的監(jiān)測(cè)收集及組分鑒定 監(jiān)測(cè) 用紫外檢測(cè)儀進(jìn)行，在 280nm處觀察洗脫液的光吸收 收集 用分步收集器收集，可以自動(dòng)收集，也可以手動(dòng)收集 鑒定 聚丙烯酰胺凝膠電泳、測(cè)定活性等 離子交換劑的清洗、再生和保存 清洗 ?可溶于堿的污染物 mol/L NaOH洗滌 MilliQ純化的蒸餾水洗滌 結(jié)合緩沖液洗滌 可以除去諸如脂類、蛋白質(zhì)和核酸這類的污染物。 優(yōu)點(diǎn)： 凝膠屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，溫度范圍廣，不需要有機(jī)溶劑，分離效果好 缺點(diǎn)： 樣品被不斷稀釋，上樣量不能太大，否則分辨率變差 （一）原理 凝膠是一種 不帶電的具有三維空間的 多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，每個(gè)顆粒的細(xì)微結(jié)構(gòu)及篩孔的直徑均勻一致， 小分子可以進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔 ，而 大分子則排阻于顆粒之外 。 洗脫行為可以有三種可能的情況 : 凝膠 Kd＝ 0 Kd=l 0Kd l ﹡ Kd＝ (VeVo)／ Vi 影響分離效果的因素 流速 加樣體積 樣品濃度 離子強(qiáng)度 ① 流速 ?影響洗脫液流速的因素 ?洗脫液加在柱上的 壓力 為保持層析過(guò)程中恒定的壓力，可使用恒壓瓶。 1215 300070000 100050000 24 3 4905(50) Sephdex G100 中粗 超細(xì) 40120 1040 10177。 多孔硅膠 ?優(yōu)點(diǎn)： 物理化學(xué) 穩(wěn)定性高 ， 耐熱耐壓 ，使用 壽命長(zhǎng) ?缺點(diǎn)： 柱效較低 、表面具有離子性，對(duì)蛋白質(zhì)有 吸附性 、不能在強(qiáng)堿性環(huán)境中使用 剛性親水性填料，具有一定直徑的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的球狀顆粒 （三）基本操作 凝膠的選擇 凝膠柱的制備 上樣 洗脫 凝膠柱的重復(fù)使用與保存 凝膠的選擇 分組分離 根據(jù)樣品中的大分子和小分子 分配系數(shù)上的顯著差異 ，將其分開(kāi)。 ? 在半收縮狀態(tài)下保存： 60%70%酒精 液洗沖，凝膠 體積縮小后冷藏或常溫保存。 疏水性弱的物質(zhì)，在較高離子強(qiáng)度的溶液時(shí)被洗脫下來(lái)，當(dāng)離子強(qiáng)度降低時(shí)，疏水性強(qiáng)的物質(zhì)才隨后被洗脫下來(lái)。 HIC柱的再生、清潔和貯存 輕度 污染時(shí) 蒸餾水 洗滌 污染物 緊密結(jié)合 時(shí) 6 mol/L尿素 或 6 mol/L鹽酸胍 洗滌＋起始緩沖液或貯存緩沖液洗滌 NaOH可用于溶解變性和沉淀的蛋白質(zhì)及脂類 未使用的介質(zhì)儲(chǔ)存在 封閉的容器 中，在 425℃ 的條件下保存 用過(guò)的介質(zhì)應(yīng)貯存在含有適當(dāng) 抑菌劑 的溶液中，在4 ～ 8℃ 的條件下保存， 不得冷凍 五、親和層析 (affinity chromatography) （一）原理 親和層析 利用生物大分子與其配體之間具有專一性親和力而設(shè)計(jì)的層析技術(shù)。 改善方法： 選擇親和力強(qiáng)的物質(zhì)洗脫、加大洗脫液濃度 特異性洗脫 非特異性洗脫 與配體親和力較小 連續(xù) 大體積平衡緩沖液沖洗 ，不影響活性，但洗脫體積較大，待分離物質(zhì)濃度較低。 （二）流程及主要部件 (1) 高壓輸液泵 ? 主要部件之一，壓力： 150～ 350 105 Pa。 差值與濃度呈正比； 通用型檢測(cè)器 （每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù) ） ； 靈敏度低 、 對(duì)溫度敏感 、 不能用于梯度洗脫； 偏轉(zhuǎn)式 、 反射式和干涉型三種； (5) 高效分離柱 柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑 1～ 6 mm，柱長(zhǎng) 5～ 40 cm。 1. 表面多孔型固定相 它的基體是實(shí)心玻璃球 ， 在玻璃球外面覆蓋一層多孔活性材料 ， 如硅膠 、 氧化硅 、 離子交換劑 、 分子篩 、 聚酰胺等 。 （ 3） 若流動(dòng)相的極性大于固定液的極性 ， 則稱為反相液液色譜 ， 非極性柱也稱為反相柱 。 常用溶劑的極性順序： 水 (最大 ) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮二氧六環(huán) 四氫呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 異丙醚 二氯甲烷 氯仿 溴乙烷 苯 四氯化碳 二硫化碳 環(huán)己烷 己烷 煤油 (最小 )。常用的低粘度溶劑有丙酮、甲醇和乙腈等。區(qū)帶電泳由于采用的介質(zhì)不同以及技術(shù)上的差異，又可分為不同的類型。 ⑤ 聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測(cè)。 CH C=O NH2 CH2CH C=O NH2 CH2CH CH2CH CH2CH C=O NH2 CH2CH CH2CH ( )n ( )n ( )m ( )m 1. 聚丙烯酰胺凝膠的制備 聚丙烯酰胺凝膠聚合為自由基聚合，其催化體系有兩種： 1） 化學(xué)聚合 化學(xué)聚合的催化劑（引發(fā)劑）通常采用 過(guò)硫酸銨（ ammonium persulfate， Ap），此外還需要加速劑TEMED（ N， N， N’， N’四甲基乙二胺），它能以自由基的形式存在。 （ 3） 有些材料如聚丙烯酸甲酯有機(jī)玻璃，一些金屬等可抑制聚合反應(yīng)。因此，把濃度為 % 凝膠稱為 標(biāo)準(zhǔn)膠 。 在這樣一個(gè)不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在三種物理效應(yīng)，即樣品的濃縮效應(yīng)，凝膠的分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)，由于這三種物理效應(yīng)，使樣品分