【正文】 的活性會隨著某些有機(jī)溶劑濃度升高而增大，在某一濃度（最適濃度）達(dá)到最大值；若濃度再升高，則活性下降。因此非水體系又稱低水體系。 （一）有機(jī)相酶反應(yīng)具備條件 1． 保證必需水含量。 (2) 在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以改變酶促反應(yīng)的熱力學(xué)平衡向有利于合成方向（而不是水解方向）進(jìn)行。 膜反應(yīng)器 連續(xù)式 游離酶 固定化酶 清洗比較困難 噴射式反應(yīng)器 連續(xù)式 游離酶 通入高壓噴射蒸汽，實(shí)現(xiàn)酶與底物的混合，進(jìn)行高溫短時催化反應(yīng)，適用于某些耐高溫酶的反應(yīng) 1984年 A. Zaks 和 Klibanov 首次發(fā)表了關(guān)于非水相介質(zhì)中脂肪酶的催化行為及熱穩(wěn)定性的研究報(bào)道，引起了廣泛的關(guān)注。 膜反應(yīng)器可以制成平板型、螺旋型、管型、中空纖維型、轉(zhuǎn)盤型等多種形狀。 適用于固定化酶進(jìn)行連續(xù)催化反應(yīng)。 適于有底物抑制場合 。 （五）固定化酶的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)： 極易將產(chǎn)物和底物分開；可以在較長時間內(nèi)進(jìn)行反復(fù)分批反應(yīng)和裝柱連續(xù)反應(yīng)；在大多數(shù)情況下，可以提高酶的穩(wěn)定性；酶反應(yīng)過程可以嚴(yán)格控制；產(chǎn)物中沒有酶的殘留，簡化了工業(yè)設(shè)備；較水溶性酶更適合于多酶反應(yīng)；可以增加產(chǎn)物的收得率，提高產(chǎn)物的質(zhì)量；酶使用效率提高，成本降低。在一般情況下，固定化后酶的失活速度下降，最適溫度也隨之提高。在選用固定化細(xì)胞作為催化劑時，應(yīng)考慮到底物和產(chǎn)物是否容易通過細(xì)胞膜，膜內(nèi)是否存在產(chǎn)物分解系統(tǒng)和其他副反應(yīng)系統(tǒng)，或者說雖有這兩種系統(tǒng)，但是否可事先用熱處理或pH值調(diào)整等簡單方法使之失效。常與交聯(lián)法結(jié)合達(dá)到加固的目的，如先用明膠包埋，再用戊二醛交聯(lián)等。 特點(diǎn)：反應(yīng)條件比較激烈，固定化酶的活力回收率較低，但盡量降低交聯(lián)劑濃度和縮短反應(yīng)時間，會有助于固定化酶比活力的提高。 （ 1）共價結(jié)合法。吸附的載體：包括無機(jī)載體（活性炭、石英砂、多孔玻璃、氧化鋁、硅膠、磷酸鈣）和有機(jī)載體（淀粉、谷蛋白、纖維素、葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺）等。 酶偶聯(lián)法 指選擇另一種酶與酶發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，即第一種酶 E1所催化的產(chǎn)物作為 E2的底物，通過測定第二個酶促反應(yīng)產(chǎn)物的量變化來測的活力，此法適用于活力不高或所催化產(chǎn)物不便測定的一些酶活力測定。 如蛋白酶的活力，可據(jù)酶催化酪蛋白水解生成的酪氨酸與酚試劑作用藍(lán)色反應(yīng)，再用比色法測定之。 ，為選擇適當(dāng)方法和條件提供了直接依據(jù)。可以分離和檢出等電點(diǎn)相差僅 。 離子交換劑根據(jù)活性基團(tuán)的性質(zhì)分為陽離子交換劑和陰離子交換劑。透析結(jié)束時，透析袋內(nèi)的保留液體積較大，濃度較低。 在酶液中加入某些高分子聚合物，例如，單寧，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來，分離出沉淀后，再用適當(dāng)方法將酶從復(fù)合物中重新析出。 ③ 提取方法的經(jīng)濟(jì)性和可分析性 盡量減少添加劑的使用 盡早使用高效分離方法 ， 將昂貴 、 費(fèi)時的分離方法放在最后階段 。 酶的精制 :即高度純化。 （一）機(jī)械破碎法 適合于細(xì)菌和酵母的破碎，不適合于絲狀真菌及某些基因工程菌。 （ 3）產(chǎn)酶量高，而且最好產(chǎn)生胞外酶。 H O O C C H = C H C O O H H 2 O H O O C C H 2 C H C O O HO H5．異構(gòu)酶 (Isomerase) ? 此類酶為生物代謝需要對某些物質(zhì)進(jìn)行分子異構(gòu)化，分別進(jìn)行外消旋、差向異構(gòu)、順反異構(gòu)等，分為差相異構(gòu)酶、消旋酶、順反異構(gòu)酶等 6．連接酶（合成酶） (Ligase or Synthetase) ?合成酶，又稱為連接酶，能夠催化 CC、 CO、 CN 以及 CS 鍵的形成反應(yīng)。 ?如，乳酸 (Lactate)脫氫酶催化乳酸的脫氫反應(yīng)。 一、酶工程概述 酶工程是現(xiàn)代生物技術(shù)的重要組成部分。 1949 大規(guī)模工業(yè)化階段（液體深層發(fā)酵）細(xì)菌淀粉酶 70年代后期，酶的固定化技術(shù)取得了突破，使固定化酶、固定化細(xì)胞、生物反應(yīng)器與生物傳感器等酶工程技術(shù)迅速獲得應(yīng)用。 C H 3 C H C O O HN H 2H O O C C H 2 C H 2 C C O O HOH O O C C H 2 C H 2 C H C O O HN H 2C H 3 C C O O HO3．水解酶 (Hydrolase) H 2 OC O O C H2 C H 3R R C O O H C H 3 C H 2 O H?水解酶催化底物的加水分解反應(yīng)（或逆反應(yīng)）。 ? 丙酮酸 + CO2 ? 草酰乙酸 酶用于生物催化的概況 類別 占總酶比例 % 利用率 % 水解酶 hydrolases 26 65 氧化還原酶oxidoreductases 27 25 轉(zhuǎn)移酶 transferases 24 5 裂合酶 lyases 12 ~5 異構(gòu)酶 isomerases 5 ~1 連接酶 ligases 6 ~1 國際系統(tǒng)命名法 ?系統(tǒng)名稱包括底物名稱、構(gòu)型、反應(yīng)性質(zhì)，最后加一個酶（ ase）字。 液體深層發(fā)酵 液體培養(yǎng)基，在發(fā)酵容器中，經(jīng)滅菌、冷卻接入產(chǎn)酶細(xì)胞，在一定條件下發(fā)酵，是目前酶生產(chǎn)的主要方法。 （二）非機(jī)械破碎法 加酶法 :常用的有溶菌酶、蛋白酶、糖苷酶等，它們對細(xì)胞壁或細(xì)胞膜進(jìn)行酶解，使細(xì)胞破碎。 分離： 將酶從原料中抽提出來 ， 并盡可能少引入雜質(zhì) ， 得到粗酶液 純化： 將酶和雜質(zhì)中分離開來 ， 或者有選擇地將酶從包含雜質(zhì)中分離出來 ， 得到一定純度的酶 。其中以硫酸銨最為常用，因?yàn)樗谒械娜芙舛却蠖鴾囟认禂?shù)小，不影響酶的活性，分離效果好，而且價廉易得。常用的凝膠有瓊脂糖凝膠（ Sepharose）、聚丙烯酰胺凝膠（ Biogel）和葡聚糖凝膠（ Sephadex）等。 借助于超濾膜將不同相對分子質(zhì)量的物質(zhì)分離的技術(shù)，是在一定的正壓力或負(fù)壓力驅(qū)動下，將料液強(qiáng)制通過一定孔徑的超濾膜，部分小分子的溶質(zhì)和溶劑透過膜而成為超濾液，而大分子的酶和蛋白質(zhì)等物質(zhì)被截留，從而達(dá)到分離純化的目的，也可用于酶液的濃縮和脫色。為了減少對流擴(kuò)散，電泳過程一般在浸透了緩沖液的聚丙烯酰胺凝膠、淀粉膠等介質(zhì)上進(jìn)行。 利用抗原一抗體的高親和性反應(yīng)原理進(jìn)行酶的分離純化。酶分子結(jié)構(gòu)高度復(fù)雜，同一種酶制劑，采用不同方法檢驗(yàn)結(jié)果可能不一致，酶的純度應(yīng)注明達(dá)到哪種純度，如電泳純、 HPLC純等。 中止反應(yīng)法 : 在恒溫反應(yīng)系統(tǒng)中進(jìn)行酶促反應(yīng)，間隔一定的時間，分幾次取出一定容積的反應(yīng)液，使酶停止作用，然后分析產(chǎn)物的生成量或底物的消耗量。 方法：終止法 熱變性 測吸光度 酶法分析 底物濃度對酶速的影響 酶法分析包括兩個步驟： 在適宜的條件下進(jìn)行催化反應(yīng) 測定反應(yīng)前后物質(zhì)的變化情況，可以測定底物的減少、產(chǎn)物的增加或輔酶的變化 游離酶催化的缺點(diǎn)： ：在高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等外界因素下易失活。 （ 2）離子吸附法。 特點(diǎn)：反應(yīng)條件苛刻，操作復(fù)雜，容易使酶的高級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而破壞活性中心，操作時需注意。 優(yōu)點(diǎn)：一般不需要與酶蛋白的氨基酸殘基起結(jié)合反應(yīng)，較少改變酶的高級結(jié)構(gòu)，酶活力的回收率較高。 缺點(diǎn)：反應(yīng)條件要求高，制備成本高。固定化酶的穩(wěn)定性常用半衰期（ t1/2）表示，即固定化酶活力降為最初活力一半所經(jīng)歷的連續(xù)工作時間。 （ 四 ） 固定化酶 （ 細(xì)胞 ） 的評價指標(biāo) 具有相同重量酶蛋白的固定化酶與游離酶活力的比值 。 發(fā)酵生產(chǎn)過程示意圖 過程調(diào)控 發(fā)酵罐 滅菌 原料 預(yù)處理 產(chǎn)物分離提純 產(chǎn)品 菌種培養(yǎng) 空氣 除菌 能量 熱量 生物催化反應(yīng)過程示意圖 過程調(diào)控 生物催化反應(yīng)器 底物 產(chǎn)物分離提純 產(chǎn)品 生物催化劑制備 能量 生物反應(yīng)器的特點(diǎn) 優(yōu)良的生物反應(yīng)器應(yīng)具備： 、傳熱性能 酶反應(yīng)器較發(fā)酵罐簡單 生物反應(yīng)器 工程 通過反應(yīng)器型式 、 操作方式的改變能否使生物催化反應(yīng)效率最大化 ？ ?將反應(yīng)與傳質(zhì)緊密相關(guān) 酶反應(yīng)器： 用于游離或固定化酶（細(xì)胞）進(jìn)行催化反應(yīng)的容器及其附屬設(shè)備。它適用于各種形狀的固定化酶和不含固體顆粒、黏度不大的底物溶液，以及接近平推流，當(dāng)有產(chǎn)物抑制時，可獲得高轉(zhuǎn)化效率。 但因 FBR混合均勻，故不適用于有產(chǎn)物抑制的酶反應(yīng)。 反應(yīng)器類型 適用的操作方式 適用的酶 特點(diǎn) 攪拌罐式反應(yīng)器 分批式 , 流加分批式 連續(xù)式 , 游離酶 固定化酶 反應(yīng)比較完全，反應(yīng)條件容易調(diào)節(jié)控制。 八 非水介質(zhì)中的酶催化反應(yīng) 非水相介質(zhì)：有機(jī)溶劑反應(yīng)介質(zhì)，氣相反應(yīng)介質(zhì)，超臨界流體反應(yīng)介質(zhì)。 (6) 脂溶性底物和產(chǎn)物在有機(jī)溶劑中的高度溶解性 , 有利于提高底物濃度總的水平。 4． 選擇最佳 pH值。 (2)對底物和產(chǎn)物的影響，有機(jī)溶劑可以直接與底物、產(chǎn)物分子發(fā)生反應(yīng)，或者可以通過底物和產(chǎn)物在水相和有機(jī)相的分配，從而影響其在酶分子表面的水層中的濃度來改變酶的活性。 （三）專一性 某一些有機(jī)介質(zhì)可能使某些酶的專一性發(fā)生變化，這是酶活性中心構(gòu)象剛性增強(qiáng)的結(jié)果。 例： α胰凝乳蛋白酶與聚丙烯酰胺凝膠共價結(jié)合后，在乙醇中的穩(wěn)定性明顯提高，并且對有機(jī)溶劑的抗性隨酶與載體間共價鍵數(shù)量的增加而增強(qiáng)。與 α 淀粉酶相同， β 淀粉酶也不能水解α 1,6糖苷鍵，形成 β 極限糊精，麥芽糖的含量僅為 60%。 （ ） 能夠?qū)⑵咸烟寝D(zhuǎn)化成果糖，它是加工果糖和高果糖漿（ HFCS）的重要酶類。 果葡糖漿溶解度高，發(fā)酵性能好，化學(xué)穩(wěn)定性高，并且易為人體所吸收，因此，在飲料工業(yè)廣泛應(yīng)用，在面包、糕點(diǎn)、罐頭和冷飲等領(lǐng)域也有不同程度的應(yīng)用。 （ 2） 防止乳糖結(jié)晶 乳糖溶解度較低 ， 在高濃度時會結(jié)晶析出 ， 一些濃縮乳清在貯運(yùn)中會出現(xiàn)乳糖結(jié)晶 ， 還有一些濃縮乳制品如甜煉乳 ， 由于乳糖結(jié)晶析出影響產(chǎn)品外觀和保藏 。 （ ） 奶酪加工中一個重要的步驟就是要使液態(tài)乳轉(zhuǎn)變成凝乳 ， 這個凝結(jié)過程是采用凝乳酶類來催化完成 。此外，還可將脂肪酶添加到奶油中，以增加奶油的風(fēng)味。 在葡萄酒生產(chǎn)中，同果蔬汁加工相同，果膠酶也是在果實(shí)破碎后加入，用量為～ 4mL／ 100 L，處理溫度 15～ 35℃ ，酶解時間為 3～ 10d。纖維素酶能夠?qū)⒅参锢w維素水解為纖維二糖和葡萄糖，使細(xì)胞內(nèi)容物得以充分釋放。 能夠?qū)?β D吡喃葡萄糖氧化形成葡萄糖酸，同時消耗氧氣。 在魚制品加工中 ， 當(dāng)原料品質(zhì)較差時（ 如凍魚 ） ， 可以通過添加轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶提高產(chǎn)品的凝膠強(qiáng)度 。 （ 短 ） 鏈脂肪酸酯的合成 中（短）鏈脂肪酸具有氧化穩(wěn)定性、較低的熔點(diǎn)及黏度、代謝容易被吸收并且能夠迅速提供能量等優(yōu)點(diǎn)。 β 葡聚糖酶起到分解 β 葡聚糖調(diào)節(jié)啤酒酒精度的作用，并且有助于啤酒過濾。 小麥粉中 β 淀粉酶含量和活性基本上能滿足焙烤要求。許多面粉不具備這種性質(zhì)，而且蛋白酶活性很低，要外加蛋白酶來降解面筋，提高面筋的水解程度。 ?環(huán)狀糊精的作用 ： 使易揮發(fā)、氧化和光分解的物質(zhì)穩(wěn)定化 食品中易揮發(fā)的香精、香料及食品中的香味物質(zhì)，食品中易氧化及遇光和熱易分解的色素、維生素、生理活性物質(zhì)等，可借助 環(huán)狀糊精 和它們所形成的包接絡(luò)合物使其穩(wěn)定化。 （ 3）不被口腔內(nèi)微生物利用，不會引起齲齒。 生產(chǎn)異麥芽低聚糖的關(guān)鍵酶為 α 葡萄糖苷酶，又稱葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶 ，它能切開麥芽糖和低聚麥芽糖分子中的 α 1,4糖苷鍵，并將游離出的一個葡萄糖殘基轉(zhuǎn)移到另一個葡萄糖分子或麥芽糖、麥芽三糖分子的 α 1,6位上形成異麥芽糖、異麥芽三糖、異麥芽四糖等分支低聚糖。低聚果糖是腸道內(nèi)雙歧桿菌的活化增殖因子，具有低聚糖的一般功能。一般以富含木聚糖（ xylan）的植物材料（如玉米芯、蔗渣、棉子殼、麩皮等）為原料，通過木聚糖酶的水解作用分離精制而獲得。 大豆肽的氨基酸組成與大豆蛋白相同，必需氨基酸平衡且含量豐富，同時無蛋白質(zhì)變性，無豆腥味。