【正文】 了緩沖液的聚丙烯酰胺凝膠、淀粉膠等介質(zhì)上進(jìn)行。但現(xiàn)在已發(fā)展了制備電泳，用這種方法制備的酶，可以在介質(zhì)中洗脫或直接從電泳柱底部依次流出。 優(yōu)點(diǎn)：不但可將各種酶精確分開，通過(guò)測(cè)定各段的 pH值還可以了解該酶的等電點(diǎn)。 （ 四 ） 根據(jù)酶分子專一性結(jié)合的分離方法 酶的底物、底物類似物及酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑同酶之間有著較高的親和力，可作為配基固定于不溶性載體，可選擇性地將酶吸附而同雜質(zhì)分離。 利用抗原一抗體的高親和性反應(yīng)原理進(jìn)行酶的分離純化。 建立一個(gè)可靠和快速、易行的測(cè)定酶活方法 物理因素、化學(xué)因素和生物因素導(dǎo)致酶失活 （經(jīng)濟(jì)、宜行）： 純化倍數(shù)、酶活回收率和重現(xiàn)性 （衡量?jī)?yōu)劣） 經(jīng)濟(jì)、可靠，建立靈敏、快速、特異、精確的檢測(cè)（酶活和蛋白質(zhì)的含量）手段。 盡可能除去，因此選擇分離方法是應(yīng)盡可能不破壞酶所需要的條件。 一個(gè)好的酶分離純化的方法和措施是使酶的純度提高倍數(shù)大，活力回收高，同時(shí)重復(fù)性好。酶分子結(jié)構(gòu)高度復(fù)雜，同一種酶制劑，采用不同方法檢驗(yàn)結(jié)果可能不一致，酶的純度應(yīng)注明達(dá)到哪種純度，如電泳純、 HPLC純等。一般情況下，酶的比活力隨酶的純度的提高而提高。 酶活力測(cè)定方式有二 ： ?1. 測(cè)定一定時(shí)間內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)的量 通常測(cè)定在一定時(shí)間內(nèi)最適于酶的條件下酶促反應(yīng)產(chǎn)物的生成量。 ?2. 測(cè)定完成一定量反應(yīng)所需的時(shí)間，測(cè)定酶所催化的一定量底物的減少或一定量產(chǎn)物的生成所需的時(shí)間，酶活力與之成反比。 中止反應(yīng)法 : 在恒溫反應(yīng)系統(tǒng)中進(jìn)行酶促反應(yīng)，間隔一定的時(shí)間，分幾次取出一定容積的反應(yīng)液，使酶停止作用，然后分析產(chǎn)物的生成量或底物的消耗量。 連續(xù)反應(yīng)法 : 不需要取樣中止反應(yīng)，而是基于反應(yīng)過(guò)程中光譜吸收、氣體體積、酸堿度、溫度、黏度等的變化，用儀器跟蹤檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)行的過(guò)程，記錄結(jié)果，算出酶活力。 自動(dòng)化酶分析儀 : 從加樣、啟動(dòng)反應(yīng)、檢測(cè)、數(shù)據(jù)記錄及結(jié)果處理等，整個(gè)過(guò)程均由儀器自動(dòng)完成。 舉例： α淀粉酶活力測(cè)定 原理：淀粉對(duì)碘呈藍(lán)黑色的特異性逐漸消失，消失的速率與酶活性有關(guān)。 方法：終止法 熱變性 測(cè)吸光度 酶法分析 底物濃度對(duì)酶速的影響 酶法分析包括兩個(gè)步驟： 在適宜的條件下進(jìn)行催化反應(yīng) 測(cè)定反應(yīng)前后物質(zhì)的變化情況，可以測(cè)定底物的減少、產(chǎn)物的增加或輔酶的變化 游離酶催化的缺點(diǎn)： ：在高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等外界因素下易失活。 ：酶與產(chǎn)物混在一起。酶被物理吸附于不溶性載體的一種固定化方法。 優(yōu)點(diǎn)：具有不破壞酶活性中心和酶高級(jí)結(jié)構(gòu)變化少，若能找到適當(dāng)?shù)妮d體，這是簡(jiǎn)單的好方法。 （ 2）離子吸附法。 常見(jiàn)的載體： DEAE纖維素、 DEAE葡聚糖凝膠、 CM纖維素、 DOWEX50等。 缺點(diǎn)：酶與載體的結(jié)合力較弱，當(dāng)離子強(qiáng)度高、緩沖液種類或 pH值發(fā)生變化時(shí)，酶容易脫落。將載體有關(guān)基團(tuán)活化、與酶分子上的功能團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)形成共價(jià)鍵的一種固定化方法，是研究得最多的固定化方法之一。 特點(diǎn)：反應(yīng)條件苛刻，操作復(fù)雜，容易使酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而破壞活性中心，操作時(shí)需注意。 通過(guò)雙功能或多功能試劑 （ 交聯(lián)劑 ） ， 在酶分子之間或酶分子與微生物細(xì)胞之間形成共價(jià)鍵的連接方法 。 常用的交聯(lián)劑：戊二醛 、 異氰酸酯 、 順丁烯二酸酐和乙烯共聚物等 。 可分為凝膠網(wǎng)格型和微囊型。 優(yōu)點(diǎn)：一般不需要與酶蛋白的氨基酸殘基起結(jié)合反應(yīng)，較少改變酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)，酶活力的回收率較高。 （ 1）凝膠網(wǎng)格型。 缺點(diǎn)：凝膠孔徑不規(guī)則，有一部分大于平均孔徑，時(shí)間稍長(zhǎng)時(shí)，酶容易泄漏。 （ 2）微囊型。 缺點(diǎn)：反應(yīng)條件要求高，制備成本高。固定化細(xì)胞的制備方法類似于固定化酶的制備方法。 缺點(diǎn)：只適用于胞內(nèi)酶，而且細(xì)胞中的酶很多，可能產(chǎn)生副反應(yīng)，使產(chǎn)物不純。 （三）固定化酶（細(xì)胞）的性質(zhì) 酶經(jīng)固定化后，酶分子的構(gòu)象可能改變，導(dǎo)致了酶與底物結(jié)合能力或催化底物轉(zhuǎn)化能力發(fā)生變化；載體的存在給酶的活性部位或調(diào)節(jié)部位造成某種空間障礙，影響酶與底物的作用；酶包埋于載體，底物必須擴(kuò)散進(jìn)入載體才能和酶分子接觸，擴(kuò)散速率的不同限制了酶與底物的作用。固定化酶的穩(wěn)定性常用半衰期（ t1/2）表示，即固定化酶活力降為最初活力一半所經(jīng)歷的連續(xù)工作時(shí)間。 pH值的變化 氫離子在溶液和固定化酶之間的分配效應(yīng) ， 對(duì)反應(yīng)速度具有重要影響 。 酶反應(yīng)的最適溫度是酶失活速度與酶反應(yīng)速度綜合的結(jié)果。 酶固定于電中性載體后，表觀米氏常數(shù)往往比游離酶的米氏常數(shù)高，而最大反應(yīng)速度變?。欢?dāng)?shù)孜锱c帶有相反電荷的載體結(jié)合后，表觀米氏常數(shù)往往減小，這對(duì)固定化酶實(shí)際應(yīng)用有利。 （ 四 ） 固定化酶 （ 細(xì)胞 ） 的評(píng)價(jià)指標(biāo) 具有相同重量酶蛋白的固定化酶與游離酶活力的比值 。 相對(duì)酶活力低于 75%的固定化酶 ， 一般無(wú)實(shí)際應(yīng)用價(jià)值 。一般情況下，活力回收率應(yīng)小于 l。 缺點(diǎn)： 固定化時(shí)，酶活力有損失；增加了固定化的成本，工廠投資開始增大；只能用于水溶性底物，而且較適用于小分子底物，對(duì)大分子底物不適宜；與完整菌體相比，不適合多酶反應(yīng)，特別是需要輔助因子的反應(yīng)；胞內(nèi)酶必須經(jīng)過(guò)酶的分離過(guò)程。 發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程示意圖 過(guò)程調(diào)控 發(fā)酵罐 滅菌 原料 預(yù)處理 產(chǎn)物分離提純 產(chǎn)品 菌種培養(yǎng) 空氣 除菌 能量 熱量 生物催化反應(yīng)過(guò)程示意圖 過(guò)程調(diào)控 生物催化反應(yīng)器 底物 產(chǎn)物分離提純 產(chǎn)品 生物催化劑制備 能量 生物反應(yīng)器的特點(diǎn) 優(yōu)良的生物反應(yīng)器應(yīng)具備： 、傳熱性能 酶反應(yīng)器較發(fā)酵罐簡(jiǎn)單 生物反應(yīng)器 工程 通過(guò)反應(yīng)器型式 、 操作方式的改變能否使生物催化反應(yīng)效率最大化 ？ ?將反應(yīng)與傳質(zhì)緊密相關(guān) 酶反應(yīng)器： 用于游離或固定化酶（細(xì)胞）進(jìn)行催化反應(yīng)的容器及其附屬設(shè)備。 1． 分批攪拌反應(yīng)器 （ Batch Stirred Tank Reactor, BSTR） 反應(yīng)器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，不需要特殊裝置，適與小規(guī)模試驗(yàn) 缺點(diǎn)是：操作麻煩，固定化酶經(jīng)反復(fù)回收使用時(shí)，易失去活性，故在工業(yè)生產(chǎn)中，間歇式酶反應(yīng)器很少用于固定化酶，但常用于游離酶。 運(yùn)轉(zhuǎn)過(guò)程中要不斷分出部分反應(yīng)液，同時(shí)補(bǔ)充等量的新鮮底物溶液，為不致使酶隨反應(yīng)液流失，所以在它的出口處通常有濾膜。 缺點(diǎn)是：攪拌漿剪切力大，易打碎磨損固定化酶顆粒 3． 連續(xù)攪拌罐 超濾反應(yīng)器 酶循環(huán) （二）填充（固定）床式反應(yīng)器（ PBR） 固定化酶堆疊在一起，固定不動(dòng)，底物溶液按照一定的方向以一定的速度流過(guò)反應(yīng)床，通過(guò)底物溶液的流動(dòng)，實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的傳遞和混合。它適用于各種形狀的固定化酶和不含固體顆粒、黏度不大的底物溶液，以及接近平推流，當(dāng)有產(chǎn)物抑制時(shí)，可獲得高轉(zhuǎn)化效率。當(dāng)?shù)孜锶芏群腆w顆?；蝠ざ群艽髸r(shí)，不宜采用 PBR。 可用于處理粘性強(qiáng)和含有固體顆粒的底物，或用于需要供應(yīng)氣體或排放氣體的反應(yīng)。 流化床反應(yīng)器（ Fluidized Bed Reactor, FBR）。 但因 FBR混合均勻，故不適用于有產(chǎn)物抑制的酶反應(yīng)。 五、膜反應(yīng)器 將酶催化反應(yīng)與半透膜的分離作用組合在一起而成的反應(yīng)器。 用于固定化酶催化反應(yīng)的膜反應(yīng)器是將酶固定在具有一定孔徑的多孔薄膜中，而制成的一種生物反應(yīng)器。常用的是中空纖維反應(yīng)器。 反應(yīng)器類型 適用的操作方式 適用的酶 特點(diǎn) 攪拌罐式反應(yīng)器 分批式 , 流加分批式 連續(xù)式 , 游離酶 固定化酶 反應(yīng)比較完全，反應(yīng)條件容易調(diào)節(jié)控制。在工業(yè)生產(chǎn)中普遍使用。 反應(yīng)器類型 適用的操作方式 適用的酶 特點(diǎn) 鼓泡式反應(yīng)器 分批式 流加分批式 連續(xù)式 游離酶 固定化酶 鼓泡式反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作容易，剪切力小，混合效果好，傳質(zhì)、傳熱效率高 ,適合于有氣體參與的反應(yīng)。傳統(tǒng)的酶學(xué)領(lǐng)域迅速產(chǎn)生一個(gè)全新的分支 ?非水酶學(xué)。 八 非水介質(zhì)中的酶催化反應(yīng) 非水相介質(zhì)：有機(jī)溶劑反應(yīng)介質(zhì)，氣相反應(yīng)介質(zhì)，超臨界流體反應(yīng)介質(zhì)。因而使通過(guò)選擇不同性質(zhì)的溶劑來(lái)調(diào)控酶的某些特性成為可能。 (3) 由于引起酶變性的許多因素都與水的存在有關(guān) , 因此在有機(jī)介質(zhì)中酶的穩(wěn)定性得到顯著提高。 (5) 在有機(jī)介質(zhì)中進(jìn)行的酶促反應(yīng)，可以省略產(chǎn)物的萃取分離過(guò)程 , 提高收率，從低沸點(diǎn)的溶劑中分離純化產(chǎn)物比水中容易；酶不溶于有機(jī)介質(zhì)，易于回收再利用。 (6) 脂溶性底物和產(chǎn)物在有機(jī)溶劑中的高度溶解性 , 有利于提高底物濃度總的水平。 (7)在有機(jī)溶劑的存在下，一般不存在微生物污染問(wèn)題。應(yīng)用振蕩或攪拌改善底物及產(chǎn)物的交換是反應(yīng)的關(guān)鍵。 2． 選擇合適的酶及酶形式。 4． 選擇最佳 pH值。與酶分子緊密結(jié)合的一層左右的水分子，對(duì)酶活性至關(guān)重要的。 把有機(jī)溶劑中酶催化反應(yīng)理解為宏觀上是非水相，而微觀上是微水相反應(yīng)。 脂肪酶活性與水的關(guān)系 加水量 %(V/V) 相對(duì)活力 % 0 7 92 100 75 在反應(yīng)體系中，必需水量也決定于有機(jī)溶劑。 (2)對(duì)底物和產(chǎn)物的影響，有機(jī)溶劑可以直接與底物、產(chǎn)物分子發(fā)生反應(yīng)，或者可以通過(guò)底物和產(chǎn)物在水相和有機(jī)相的分配，從而影響其在酶分子表面的水層中的濃度來(lái)改變酶的活性。 相容性 例：對(duì)于酶促糖改性而言，使用疏水性的，與水不互溶的溶劑是不現(xiàn)實(shí)的，因?yàn)椴蝗苄缘孜锖筒蝗苄缘拿钢g無(wú)相互作用，必須用親水性的溶劑（如吡啶或二甲基甲酰胺） (2)溶劑必須對(duì)于該主反應(yīng)是惰性 例：酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)涉及到醇對(duì)于酯的親核攻擊而產(chǎn)生另一種酯，如果溶劑也是酯，就會(huì)生成以溶劑為基礎(chǔ)的酯，如果溶劑是醇，也會(huì)得到類似結(jié)果。 三、 溶劑及反應(yīng)體系的選擇 水溶性有機(jī)溶劑：甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、甘油、丙酮、乙晴等 水不溶性的有：石油醚、己烷、庚烷、苯、甲苯、四氯化碳、氯仿、乙醚、戊醚等 六 、有機(jī)介質(zhì)對(duì)酶性質(zhì)的影響 穩(wěn)定性 活性 專一性 反應(yīng)平衡方向 （一）穩(wěn)定性 （１）熱穩(wěn)定性提高 （２）儲(chǔ)存穩(wěn)定性提高 結(jié)論 在低水有機(jī)溶劑體系中，酶的穩(wěn)定性與含水量密切相關(guān)；一般在低于臨界含水量范圍內(nèi)，酶很穩(wěn)定；含水量超出臨界含水量后酶穩(wěn)定性隨含水量的增加而急劇下降。 低水有機(jī)溶劑體系中，大部分酶活性得以保存，但也有某些酶活性亦變化 例：有人對(duì)吸附在不同載體上的胰凝乳蛋白酶或乙酸脫氫酶在各種水濃度下的酶活性研究表明，酶活性隨水活度大小而變化，在一定水活度下，酶活性隨載體不同而變化 在反向微團(tuán)體系中，微團(tuán)效應(yīng)使某些酶活性增加 超活性：凡是高于水溶液中所得酶活性值的活性稱為超活性（ Superactivity）。 （三）專一性 某一些有機(jī)介質(zhì)可能使某些酶的專一性發(fā)生變化，這是酶活性中心構(gòu)象剛性增強(qiáng)的結(jié)果。 （四）反應(yīng)平衡方向 酶 合成產(chǎn)物 有機(jī)溶劑 使用濃 度（ %） 合成收率 （ %） 枯草桿菌蛋白酶 核糖核酸 酶 甘油 90 50 無(wú)色桿菌蛋白酶 人胰島素 DMF和乙醇 30 80 羧肽酶 牛胰核糖 核酸酶 甘油 90 50 凝血酶 人生長(zhǎng)激 素 甘油 80 20 嗜熱桿菌蛋白酶 天冬甜味 素 乙酸乙酯 胰凝乳蛋白酶 腦啡肽 乙醇或 DMF 七、酶形式的選擇 （ 1）酶粉： 例如：有人研究 a胰凝乳蛋白酶在酒精中轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)催化活性隨反應(yīng)體系中酶量的減少而顯著增加。 （３） 固定化酶： 把酶吸附在不溶性載體上（如硅膠、硅藻土、玻璃珠等）制成固定化酶，其對(duì)抗有機(jī)介質(zhì)變性的能力、反應(yīng)速度、熱穩(wěn)定性等都可提高。 通過(guò)選擇合適的載體可使體系中的水進(jìn)行有利分配。 例： α胰凝乳蛋白酶與聚丙烯酰胺凝膠共價(jià)結(jié)合后，在乙醇中的穩(wěn)定性明顯提高，并且對(duì)有機(jī)溶劑的抗性隨酶與載體間共價(jià)鍵數(shù)量的增加而增強(qiáng)。 例