【正文】 —— 正常人 非癡呆組 —— 非神經(jīng)系統(tǒng)疾病 —— 非癡呆神經(jīng)系統(tǒng)疾病 2） 選用相應(yīng)的試劑合，用放射免疫法測定。 4 3．本課題的特色和創(chuàng)新之處及立論根據(jù)（與 國內(nèi)外類似研究比較） 腦脊液是存在于腦室及蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)的一種無色透明液體，腦細(xì)胞的代謝產(chǎn)物可釋放到腦脊液中，腦脊液中成分的變化一定程度反應(yīng)了腦細(xì)胞的活動(dòng)情況。 4． Kanai M,Matsubara E,Isoe K,et study of cerebraospinal fluid levels of tau, Aβ 140,Aβ 142(43) in Alzheimer’s disease:A stady in Japan,Ann Neurology,1998,44:1726. 5． 王琨，丁新生，程虹。腦脊液中 β 淀粉樣蛋白檢測對老年期癡呆的診斷意義。 AD 的基本病理變化是老年斑和神經(jīng)元纖維纏結(jié)，前者的主要成分是 β 淀粉樣蛋白（ Aβ ） ，后者的主要 成分是 Tau 蛋白 。正常腦細(xì)胞內(nèi) Tau 蛋白磷酸化位點(diǎn)很少，因而不易被磷酸化，腦 脊液中 Tau蛋白的含量較少。 （二）研究基礎(chǔ)與工作條件 工作條件 1）、配有相應(yīng)的種植儀器和種植材料，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)成熟 , 加力裝置已具備。 預(yù)期研究成果 成果以論文形式發(fā)表并組織鑒定。 B）、若體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的特異性基因表達(dá)是體外細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)中沒有出現(xiàn)的，則很有可能是成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞耦聯(lián)的作用方式，可為進(jìn)一步研究兩者相互作用方式提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 與課題相關(guān)的基因芯片檢測技術(shù)比較成熟，課題組成員有一定的工作經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)，已同生物科技有限公司，生物芯片有限公司達(dá)成協(xié)議，基因芯片的制備和相關(guān)技術(shù)支持可以得到保證。 骨界面 OB、 OC 基因表達(dá)譜的時(shí)序變化 骨界面 OB、 OC 基因表達(dá)譜的時(shí)序變化 研究骨形成到骨吸收質(zhì)的變化過程中， OB、 OC 基因調(diào)控機(jī)理。 3）、 II 組：按“超”負(fù)荷力值加載后，隨機(jī)選 5 只大鼠，分成 6 小組，分別在1h 加載后，以及 24h， 48h,6d 加載（ 每天 3 次，每次 1 小時(shí)）后 取下大鼠股骨，其余方法同 I 組。 3）、 3 周后取材， 通過骨形態(tài)學(xué)計(jì)量方法分別檢測各種植體周圍骨質(zhì)的骨小梁表面成骨細(xì)胞數(shù)、骨小梁表面破骨細(xì)胞數(shù)、有成骨細(xì)胞被覆的類骨質(zhì)表面占骨小梁總表面的百分比、骨小梁吸收表面占骨小梁總表面的百分比等相關(guān)指標(biāo)檢測。 2）、通過體內(nèi)體外 OB 和 OC，在間斷力學(xué)刺激下 不同時(shí)間點(diǎn)取樣的基因表達(dá)譜的比較，研究骨系細(xì)胞基因表達(dá)的時(shí)序變化。313(1):1049. 項(xiàng)目的研究內(nèi)容、研究目標(biāo) ,以及擬解決的關(guān)鍵問題。 67A(4): 126975. 11 、 Di Palma F, Douet M, Boachon C, et al. Physiological strains induce differentiation in human osteoblasts cultured on orthopaedic biomaterial. Biomaterials. 20xx Aug。 綜上所述，骨作為一個(gè)自適應(yīng)的生物系統(tǒng)是通過多層面、多因素的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控來完成應(yīng)力作用下的骨改建，顯然以往只針對其中某一層面、若干因素的單一視角的研究，難以系統(tǒng)透徹地闡述應(yīng)力作用下骨形成和骨吸收的基因調(diào)控機(jī)制。（ 3） 由于各學(xué)者多采用體外實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)條件 不盡相同，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可比性較差，有關(guān)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的報(bào)道，特別是 力學(xué)刺激對人工種植體 骨界面骨系細(xì)胞基因表達(dá)影響的報(bào)道也極為罕見。 對力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究表明 [1214]：骨系細(xì)胞表面的離子通道在細(xì)胞膜受到力學(xué)作用數(shù)秒或數(shù)分鐘后即可引起 G 蛋白活化、第二信使釋放、蛋白質(zhì)磷酸化、生長因子的分泌、細(xì)胞骨架的變化、細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)粘附的重 建，最終導(dǎo)致基因表達(dá)的變化。 Ikegame 等 [6]發(fā)現(xiàn)：加載 6h 后，骨形成蛋白 4（ BMP4）基因表達(dá)增加，成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子 cbfa1/Osf2 也隨著 BMP4 基因表達(dá)開始表達(dá)。理想的人工種 植體或裝置應(yīng)以與骨組織緊密結(jié)合 (骨整合 Osseointegration)的形式行使其生理功能 , 然而，仍有部分植入體不能達(dá)到或保持長期的骨整合，導(dǎo)致植入體松動(dòng)、脫落和并發(fā)癥的產(chǎn)生，除了植入體材料本身的因素之外，負(fù)荷后骨組織的應(yīng)力變化也是重要的影響因素之一，且已引起眾多學(xué)者的關(guān)注。 隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展，一些人工種植體或裝置越來越多的被植入骨組織，用于治療病變和修復(fù)缺損，如人工關(guān)節(jié)、牙種植體，以及骨內(nèi)固定裝置等。目前的研究證據(jù)表明： 體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞加載研究證明 [35]：成骨細(xì)胞未受力時(shí) , 早期即刻基因 cfos、cjun 在細(xì)胞靜止期內(nèi)不表達(dá)；受 力學(xué)刺激后初期即明顯增加，其表達(dá)一般與細(xì)胞的增殖分化同時(shí)出現(xiàn)，因而其轉(zhuǎn)錄翻譯蛋白可能對其它晚應(yīng)答的基因轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用。但其原因和機(jī)理尚不清楚。這些不同信號(hào)通道是如何介導(dǎo)力學(xué)刺激，而導(dǎo)致 OB、 OC 基因表達(dá)的時(shí)空變化？是否存在某些尚不為人所知的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子？信號(hào)通路之間又是如何耦聯(lián)的？這方面的認(rèn)識(shí)尚不明確，只能從基因表達(dá)的變化來找尋方向。因此，我們相信 LCM 技術(shù)與基因芯片的有效結(jié)合，將能夠清晣地勾畫出 力學(xué)刺激后人工種植體 骨界面 OB、 OC 在 生理、病理過程中的基因表達(dá)的改變。52(6):52733. Winter LC, Walboomers XF, Bumgardner JD, Jansen versus continuous stretching effects on osteoblastlike cells in vitro. J Biomed Mater Res. 20xx Dec 15。31(3):295303. Ying SY, Lin expression in precursor cells of prostate cancer associated with activin by bination of subtractive hybridization and microarray Biophys Res Commun. 20xx Jan 2。 擬解決的關(guān)鍵問題 1）、建立動(dòng)物模型， 確定本實(shí)驗(yàn)中擬采用的“生理”負(fù)荷和“超”負(fù)荷的標(biāo)準(zhǔn)力值。如種植體明顯松動(dòng)，停止加載，取材檢測。 2）、 I 組：按“生理”負(fù)荷力值加載，隨機(jī)選 5 只大鼠，分成 6 小組，分別在1h 加載后，以及 24h, 48 h， 4d 加載（ 每天 3 次，每次 1 小時(shí)）后 取下大鼠股骨，分別分離種植體和骨組織，取與種植體交界處骨組織，采用激光捕獲顯微分離技術(shù)分別分離出成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，將每小組 5 個(gè)樣品的成骨細(xì)胞（或破骨細(xì)胞）等量混合，抽提 mRNA，逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記 cDNA, 基因芯片檢測成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的基因表達(dá)譜（基因芯片為大鼠 Oligo 基因芯片， 6000 個(gè) cDNA 的微陣列，由北京博奧生物芯片有限公司協(xié)助制備）。 生理負(fù)荷 超負(fù)荷 基因芯片 基因芯片 基因芯片 基因芯片 體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞(OB)和破骨細(xì)胞 (OC) 體外培養(yǎng)的成骨 (OB)細(xì)胞和破骨細(xì)胞 (OC) 體外 OB、 OC 基因表達(dá)譜的時(shí)序變化 體外 OB、 OC 基因表達(dá)譜的時(shí)序變化 RTPCR 法檢測 OB、 OC 表達(dá)差異最大的幾個(gè)基因； 結(jié)合基因數(shù)據(jù)庫，明確“標(biāo)記”基因及功能。近年先后承擔(dān)省科技攻關(guān)計(jì)劃市科委基金等科研項(xiàng)目積累了與該項(xiàng)目相關(guān)的工作經(jīng)驗(yàn)，特別是將力學(xué)刺激傳遞到骨系細(xì)胞的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?，為本?xiàng)目的完成奠定了基礎(chǔ)。根據(jù)本課題所測得的特異性基因表達(dá)的結(jié)果為基礎(chǔ)，針對不同應(yīng)力形式對骨系細(xì)胞基因表達(dá)的影響是否存在差異這一尚存爭論的問題，通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用聚類分析等方法，可以給出基因水平的判別。 完善補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)分析總結(jié)，完成論文。結(jié)合體外細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)，探討骨形成和骨破壞的基因調(diào)控機(jī)制以及成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的耦聯(lián)機(jī)制。 Tau 蛋白是腦細(xì)胞內(nèi)的一種功能蛋白，有形成細(xì)胞骨架、組裝和穩(wěn)定微管的作用。目前 AD 的診斷主要靠臨床表現(xiàn)、神經(jīng)心理學(xué)測試和影像學(xué)檢查，缺乏客觀的實(shí)驗(yàn)室診斷依據(jù)。 參考文獻(xiàn) 1． 丁新生，程虹，張雪玲，等。中國神經(jīng)精神疾病雜志，1999， 2： 102103。但為證實(shí)這一理論，先將非癡呆組分為正常人、非神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者和非癡呆神經(jīng)系統(tǒng)疾病三個(gè)亞組的腦脊液分別檢測，如這一理論得到證實(shí)，則將這三個(gè)亞組的腦脊液 Aβ和 Tau 蛋白的含量視為正常人的含量來分析，以增加樣本量，克服真正的正常人腦脊液來源不足的弊端。詳見表。 （ 2） 20xx 年 4 月 20xx 年 6 月 購買試劑，實(shí)驗(yàn)階段。從 年 月起，到 年 月止。 5．合同執(zhí)行過程中，乙方應(yīng)于每半年向甲方匯報(bào)一次進(jìn)展情況，整個(gè)合同完成時(shí)，及時(shí)向甲方申請驗(yàn)收