【正文】 ，構(gòu)建含有 C、 D、 E中游基因序列的 pEVP3質(zhì)粒。 文獻(xiàn)回顧不能回避?chē)?guó)內(nèi)外最新研究進(jìn)展。通過(guò)體內(nèi)毒力實(shí)驗(yàn)及體外粘附實(shí)驗(yàn)比較其與野生菌株的致病能力，以確定自然條件下形成的感受態(tài)與細(xì)菌致病的關(guān)系。 例如：蛋白質(zhì)的融合表達(dá)，理論上可以實(shí)現(xiàn)融合， 但存在“活性、表達(dá)載體選擇、純化”等問(wèn)題。 從疾病切入， 簡(jiǎn)要論述 國(guó)內(nèi)外研究成果， 并引出當(dāng)前的熱點(diǎn)研究方向。 在 70年代，未經(jīng)治療肺炎球菌感染死亡率為 3035%[1]，經(jīng)幾十年的研究，其感染引起的菌血癥死亡率仍高達(dá) 2530%[2]。 而細(xì)菌基因的轉(zhuǎn)移包括結(jié)合（ conjugation） 、 轉(zhuǎn)導(dǎo) （ transduction） 、融合 （ fusion） 及轉(zhuǎn)化 （ transformation）四種方式 ， 我們這里所要討論的是轉(zhuǎn)化 。 第二部分 如何撰寫(xiě)國(guó)家自然科學(xué)基金 申請(qǐng)書(shū) 一、摘 要（限 400字） 包括： 研究方法、內(nèi)容、目標(biāo)、科學(xué)意義等 如：“用 …… 方法（手段）進(jìn)行 …… 研究，探索 /證明 …… 問(wèn)題，對(duì)闡明 …… 機(jī)制／ 揭示 …… 規(guī)律有重要意義，為 …… 奠定基礎(chǔ)／提供 …… 思路 ” 探索肺炎鏈球菌感受態(tài)形成 對(duì)毒力表達(dá)的影響 細(xì)菌在自然狀態(tài)下可獲得感受態(tài)而發(fā)生轉(zhuǎn)化，這種基因重組方式是許多重要生命現(xiàn)象和生命過(guò)程的起始和源頭。 ⑥ 青年基金只能獲得一項(xiàng)資助。 如何申請(qǐng) 國(guó)家自然科學(xué)基金 第一部分 基金委面上項(xiàng)目 評(píng)審基本程序及重要環(huán)節(jié) 初 審： 由各學(xué)科處組織實(shí)施。 ⑤ 不具有高職的申請(qǐng)者申請(qǐng)及負(fù)責(zé)的在研面上項(xiàng) 目不超過(guò)一項(xiàng) 。 下發(fā)批準(zhǔn)、未批準(zhǔn)通知。我們可以從腫瘤組織中找到病毒的基因 ， 也可以發(fā)現(xiàn)某些病原體的 DNA在不同宿主之間的傳遞過(guò)程中發(fā)生著變異 ， 例如耐藥性在細(xì)菌中的傳播 ， 這都是 自然界中普遍存在的基因轉(zhuǎn)移現(xiàn)象 。 肺炎鏈球菌作為一種 自然界廣泛存在 的致病菌，肺炎鏈球菌可引起腦膜炎、中耳炎、鼻竇炎和敗血癥等疾病。 ( 撰寫(xiě)方法：要 緊緊圍繞 本次申請(qǐng)項(xiàng)目的主題。 要特別注意的問(wèn)題：必須對(duì)項(xiàng)目中所運(yùn)用的技術(shù)方法的原理、流程及在實(shí)際應(yīng)用中可能出現(xiàn)的問(wèn)題要十分清楚，絕不能是一種簡(jiǎn)單的移植。 根據(jù)以上研究背景， 我們的研究思路為：采用插入失活的手段，分別使基因 C、 D、 E失活，從而構(gòu)建一系列感受態(tài)缺陷菌株。 要注意參考國(guó)內(nèi)相關(guān)專(zhuān)業(yè)知名專(zhuān)家的論著。 研究?jī)?nèi)容 (一 )：通過(guò) CDE的基因失活及體外轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)得到感受態(tài)缺陷的 。 1) 做體外轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) ， 驗(yàn)證所構(gòu)建的菌株能被熒光表達(dá)報(bào)告感受態(tài)的發(fā)生 ， 且感受態(tài)缺陷菌不能發(fā)生轉(zhuǎn)化 。 2）制備基因 C、 D、 E蛋白的抗體，做 western blot。 技術(shù)路線 存在問(wèn)題： 不清楚，不詳細(xì)。 本實(shí)驗(yàn)室已掌握肺炎鏈球菌體外轉(zhuǎn)化的方法 ，而粘附及毒力實(shí)驗(yàn)的方法已有多篇報(bào)道 。 本研究從缺失肺炎鏈球菌感受態(tài)形成的關(guān)健環(huán)節(jié) C、 D、 E基因入手 ， 深入探討環(huán)境信號(hào) 、 細(xì)菌轉(zhuǎn)化過(guò)程與毒力表達(dá)的關(guān)系 ， 這是該項(xiàng)研究的特色和創(chuàng)新之處 。 4. 本研究完成后可提供一定數(shù)量的較高水平論文在國(guó)內(nèi)外發(fā)表 。 ” 選擇課題、確定主攻方向是科學(xué)研究中具 有戰(zhàn)略意義的首要問(wèn)題。 效能性原則：社會(huì)效益、經(jīng)濟(jì)效益、應(yīng)用價(jià)值等。 選題的基本方法： A、同步選擇法：與科技發(fā)展前沿、主流同步； B、階段分析選擇法：根據(jù)學(xué)科發(fā)展不同階段； C、交叉點(diǎn)選擇法：不同學(xué)科的交叉點(diǎn)； D、移植選擇法：將某學(xué)科方法移植到另一學(xué)科； E、機(jī)遇線索捕捉法：偶然發(fā)現(xiàn)、思想火花等； F、經(jīng)驗(yàn)轉(zhuǎn)移選擇法：用解決某問(wèn)題的經(jīng)驗(yàn)去解決 另一問(wèn)題； G、適應(yīng)需要選擇法： H、缺點(diǎn)列舉選擇法： 謝 謝！