【正文】 .注意：經(jīng)高壓滅菌后，,固調(diào)整pH值時(shí),；pH的大小會(huì)影響瓊脂的凝固能力，當(dāng)pH，培養(yǎng)基將會(huì)變硬，pH ，瓊脂凝固不好。濃度：5—20mg/L。用量：6—10g／L。在極低的濃度下，(105—108mg／L)就可促進(jìn)生長(zhǎng)，其次是莖和芽。（3） 肌醇：又叫環(huán)己六醇，在糖類的相互轉(zhuǎn)化中起重要作用。使用濃度在1%—5%，常用3% 作用：碳源；維持培養(yǎng)基滲透壓。2) 微量元素：／L的元素。胚培養(yǎng)用途：。三、組織培養(yǎng)的類型 植物組織培養(yǎng)：→培養(yǎng)材料：莖尖分生組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、愈傷組織培養(yǎng)、 細(xì)胞培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng) →培養(yǎng)方式：固體培養(yǎng) 液體培養(yǎng)：震蕩培養(yǎng)、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)、靜置培養(yǎng)、紙橋培養(yǎng)(1)愈傷組織培養(yǎng)：將外植體接種在培養(yǎng)基上，由于植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的存在，其細(xì)胞脫分化形成愈傷組織，然后通過再分化形成再生植株。要把這種可能性變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)性必須滿足兩個(gè)條件：1）要把這些細(xì)胞從植物體其余部分的抑制性影響下解脫出來(lái)，也就是說(shuō)必須使部分細(xì)胞處于離體的條件下。 組織培養(yǎng)分為五種類型：1）愈傷組織培養(yǎng)2）細(xì)胞培養(yǎng)3）器官培養(yǎng)（胚、花藥、子房、根、莖、葉）4）莖尖分生組織培養(yǎng)（脫毒）5）原生質(zhì)體培養(yǎng)培養(yǎng)基（culture medium ) ：是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)，為培養(yǎng)物提供生長(zhǎng)發(fā)育及分化的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及支持。一、組織培養(yǎng)的概念植物組織培養(yǎng)：是指在無(wú)菌和人工控制的條件下，利用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，對(duì)離體的植物器官（如根、莖、葉、花、果實(shí)、種子、胚、花藥、子房等）、組織（如形成層、皮層、胚乳等）、細(xì)胞（如體細(xì)胞、生殖細(xì)胞花粉等）、原生質(zhì)、幼小的植株進(jìn)行培養(yǎng)，使其再生細(xì)胞或完整的植株的技術(shù)。培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)組成：1）無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)大量元素：氮、磷、鉀、硫、鈣、鎂；2）無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)微量元素：鐵、硼、錳、銅、鋅、鉬、氯3）有機(jī)營(yíng)養(yǎng)：維生素、肌醇、氨基酸等4）植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑：生長(zhǎng)素類（2，4D、NAA、 IAA、 IBA) 細(xì)胞分裂素類(KT BA ZT ) 其他類（GA ABA)5） 附加物: 瓊脂、活性碳、一些天然復(fù)合物 氮是細(xì)胞中核酸的組成部分，也是生物體許多酶的成分，氮被植物吸收后轉(zhuǎn)化為氨基酸再生成蛋白質(zhì)被植物利用。2)要給予它們適當(dāng)?shù)拇碳?，即給予它們一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并使它們受到一定的激素的作用。愈傷組織是一種最常見的培養(yǎng)形式，因?yàn)槌o尖分生組織和一部分器官以外，其他的幾種培養(yǎng)形式最終也都要經(jīng)過愈傷組織才能再生植株。 。[Fe，B，Mn，Cu，Mo，Co等] 有機(jī)化合物(organic pound) （1）碳水化合物準(zhǔn)備室：最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是較好的碳源，可支持許多組織很好的生長(zhǎng)。 （2） 維生素(vitamin) ：作用：在細(xì)胞里主要是以各種輔酶的形式參與多種代謝活動(dòng)，這類化合物在植物細(xì)胞里主要是以各種輔酶的形式參與多種代謝活動(dòng)，對(duì)生長(zhǎng)、分化等有很好的促進(jìn)作用。使用濃度：一般為lOOmg／L，作用：適當(dāng)使用肌醇，能促進(jìn)愈傷組織的生長(zhǎng)以及胚狀體和芽的形成。生長(zhǎng)素種類：吲哚乙酸：IAA；萘乙酸：NAA；吲哚丁酸：IBA；2,4二氯苯氧乙酸2,4—D生長(zhǎng)素作用強(qiáng)弱順序：2,4—DNAAIBAIAA（2） 細(xì)胞分裂素類：作用：①促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大。瓊脂是一種由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何營(yíng)養(yǎng)。 作用：可防止菌類污染。四、培養(yǎng)基的種類、配方及特點(diǎn)培養(yǎng)基(culture medium) ：是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)。特點(diǎn)：無(wú)機(jī)鹽濃度較低，適于生根培養(yǎng)。 培養(yǎng)基的配制及其滅菌：將母液按順序擺放；取適量的蒸餾水(所需培養(yǎng)基量的2/3)入容器按需要量依次取母液及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)；加入蔗糖(30g/L)溶解加瓊脂(610g/L)，煮沸，23min；定容調(diào)PH值(pH=)；分裝培養(yǎng)瓶，封口；高壓滅菌組織培養(yǎng)常見的滅菌方法：消毒:是指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用。在108kPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達(dá)121℃。但它的整個(gè)歷史可以追溯到上世紀(jì)初。4. 40年代和50年代初期，Skoog等確定了腺嘌呤與生長(zhǎng)素的比例控制芽和根形成的主要條件之一，利用激動(dòng)素和生長(zhǎng)素在組織培養(yǎng)中控制器官分化。這是一種不同于通過芽和根的分化而形成植株的再生方式。（2）在自花授粉作物雜交育種中，或在異花授粉作物自交系選育過程中，采用花藥培養(yǎng)技術(shù)不但可縮短雜合體純合化所需的時(shí)間，而且還可以節(jié)省土地面積。（10）在無(wú)性繁殖植物中，通過對(duì)莖尖分生組織等離體材料進(jìn)行超低溫保存，不但可以大大節(jié)省空間，而且還可以避免病蟲害的侵襲。2）以植物性細(xì)胞如大小孢子體為材料，可以獲得單倍體或其它倍性的植株。特點(diǎn)：在誘導(dǎo)期，代謝活化了，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和RNA含量迅速增加，細(xì)胞核體積明顯增大。（Differentiation）特點(diǎn)：外植體細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)期和分裂期形成了無(wú)序結(jié)構(gòu)的愈傷組織。褐變的影響因素：植物種類及基因型。：在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)時(shí)，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)試管苗生長(zhǎng)異常，葉等出現(xiàn)透明或半透明的水浸狀植物矮小腫脹，失綠等現(xiàn)象稱為玻璃化現(xiàn)象。同種類植物的再生能力差異；再生條件沒有完全掌握；影響因子與脫分化因子基本一致。激素控制器官分化的模式圖: 高生長(zhǎng)激素（2,4D） 高細(xì)胞分裂素/生長(zhǎng)素 低細(xì)胞分裂素/生長(zhǎng)素外植體→脫分化 → 形成愈傷組織 → 再分化→分化成芽 → 分化成根→完整植株植物激素的應(yīng)用濃度：①離體培養(yǎng)條件下。植物組織和細(xì)胞在離體培養(yǎng)條件下，失去自行調(diào)節(jié)的能力。： 具有兩極性。:在同一塊愈傷組織或一個(gè)胚性細(xì)胞復(fù)合體上可以觀察到多個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的體細(xì)胞胚，從單個(gè)原始細(xì)胞到多細(xì)胞的原胚、球形胚、魚雷胚直至具子葉的胚狀體，這是由體細(xì)胞胚發(fā)生和分裂的不同步所致。 培養(yǎng)材料的生理狀態(tài)。3. 體細(xì)胞胚胎/體細(xì)胞胚（胚狀體）概念：指在組織培養(yǎng)中起源于一個(gè)非合子細(xì)胞、經(jīng)過胚胎發(fā)生和發(fā)育途徑（經(jīng)過原胚、球形胚、心形胚、魚雷胚和子葉胚5個(gè)時(shí)期），形成具有雙極性的胚狀結(jié)構(gòu)。苗的根、莖、葉俱全，但子葉中幾乎無(wú)營(yíng)養(yǎng)積累而極端瘦弱，在培養(yǎng)中適當(dāng)調(diào)整培養(yǎng)基配方可以防止早熟萌發(fā)3)脫分化形成愈傷組織。球型胚:成苗少,苗發(fā)育不良,缺葉綠素,子葉不發(fā)生。胚柄參與幼胚的發(fā)育5mg/L赤霉素能有效的取代胚柄的作用含義：將胚乳組織從母體上分離出來(lái)，通過離體培養(yǎng)，使其發(fā)育成完整植株的技術(shù)。1）薔薇科：蘋果，梨，桃。18. 胚乳外植體的制備：有較大的胚乳的種子，消毒剝?nèi)シN皮，培養(yǎng)；胚乳外有粘性物質(zhì)包裹的，消毒、去皮、去粘液，取出胚乳組織培養(yǎng)；有果實(shí)的種子，將果實(shí)消毒，切開幼果，取出種子，分離出胚乳組織進(jìn)行培養(yǎng)19. 胚乳愈傷組織的建立：1）愈傷組織誘導(dǎo) 胚乳接種到培養(yǎng)基上67d，細(xì)胞分裂，形成原始細(xì)胞團(tuán)，即為愈傷組織。雙子葉的合瓣花（煙草、番茄）3） 沼生目型胚乳：第一次分裂形成 2個(gè)細(xì)胞（即珠孔室、合點(diǎn)室），但接著進(jìn)行多次游離核分裂，在發(fā)育后期只有珠孔室能形成細(xì)胞壁。三）胎座和子房對(duì)胚珠培養(yǎng)的影響：胎座和子房的某些組織在胚珠發(fā)育初期起著重要作用四） 胚發(fā)育時(shí)期的影響：球形胚時(shí)期 〉合子和原胚時(shí)期：含義：將子房從母體上分離下來(lái)，置于培養(yǎng)基上，使其發(fā)育成幼苗的技術(shù)。當(dāng)從另一端溢出時(shí)，用凡士林封閉兩個(gè)孔，將子房接種于培養(yǎng)基上。 7）懸浮培養(yǎng)中要求有一定的細(xì)胞濃度，否則不生長(zhǎng)（2500050000個(gè)/ML）。3)大規(guī)模懸浮培養(yǎng)成本較高，因?yàn)樗枰渲么笮蛽u床、轉(zhuǎn)床、連續(xù)培養(yǎng)裝置、生物反應(yīng)器、倒置顯微鏡等特殊設(shè)備。討論： 1）滯后期的長(zhǎng)短主要取決于在繼代時(shí)原種培養(yǎng)細(xì)胞所處的生長(zhǎng)期和轉(zhuǎn)入細(xì)胞數(shù)量的多少。：1）植物細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)的研究（某種生長(zhǎng)限速濃度－細(xì)胞生長(zhǎng)的影響）；2)次生物質(zhì)的大量生產(chǎn)。適宜于大規(guī)模培養(yǎng)，細(xì)胞工程產(chǎn)業(yè)的技術(shù)基礎(chǔ)。加入DNA合成抑制劑，如5氨基尿嘧啶。4)植物激素 生長(zhǎng)素，細(xì)胞分裂素，乙烯。 由培養(yǎng)組織（如愈傷組織）中分離單細(xì)胞由完整的植物器官分離單細(xì)胞:葉片是分離單細(xì)胞的最好材料(機(jī)械法、酶解法)機(jī)械法和酶解法比較：機(jī)械法：細(xì)胞不受到酶的傷害； 不用質(zhì)壁分離； 細(xì)胞產(chǎn)量低； 細(xì)胞易破酶解法：細(xì)胞受到酶的傷害； 要質(zhì)壁分離； 細(xì)胞產(chǎn)量高； 細(xì)胞不易破。缺點(diǎn)：通氣狀況不好，排泄物質(zhì)易積累造成毒害或影響組織吸收。 4)遺傳研究的良好實(shí)驗(yàn)材料體系5)突變體的篩選。人們已知的3萬(wàn)多種天然產(chǎn)物中有80%來(lái)源于植物。植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng) 細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)：成批培養(yǎng)bacth culture、連續(xù)培養(yǎng)continuous culture（開放式連續(xù)培養(yǎng)、封閉式連續(xù)培養(yǎng)）、半連續(xù)培養(yǎng)semicontinuous（各種類型的培養(yǎng)個(gè)人認(rèn)為要知道的）含義：在一個(gè)培養(yǎng)體積中接種細(xì)胞和添加培養(yǎng)基后，中途不再添加培養(yǎng)基也不更換培養(yǎng)基的方式。7. 固定化培養(yǎng)細(xì)胞固定化培養(yǎng)是指將游離的細(xì)胞包埋在多糖或多聚化合物制備成的網(wǎng)狀支持物中，培養(yǎng)液呈流動(dòng)狀態(tài)進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)的一門技術(shù)。3) 培養(yǎng)物接種、取樣、無(wú)菌化等操作技術(shù)的優(yōu)化。⑷有機(jī)物或多聚化合物不能吸收培養(yǎng)基中的有效成分。有機(jī)相中:。 、棉花、玉米、甘藍(lán)、萵苣、苜蓿等人工種子制作獲得成功。 1）裸露的或休眠的繁殖體，可以直接播種，如休眠的微鱗莖和微型薯等。 5)與試管苗相比成本低，運(yùn)輸方便(體積小)，可直接播種和機(jī)械化操作。一般藻酸鈉的濃度控制在2％－3%，在CaCl2中停留實(shí)踐不要超過10min，以免膠囊太硬而影響發(fā)芽。 2）裝膜法：制備人工種子是把體細(xì)胞胚混合到一個(gè)溫度較高的膠液中，然后滴注到一個(gè)有小坑的微滴板上，隨著溫度降低變?yōu)槟z而形成膠丸。 體細(xì)胞胚誘導(dǎo)與同步化控制 ；體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)與同步化控制方法： 獲得發(fā)育正常、形態(tài)上較為一致的體細(xì)胞胚后，就要用適合的材料進(jìn)行包埋。 3）水凝膠包埋的胚狀體、不定芽以及休眠的小鱗莖等繁殖體，水凝膠中可含多種養(yǎng)分和激素，促進(jìn)繁殖體的生長(zhǎng)。五、人工種子各部分功能 一、人工種子意義：具有繁殖速度快、結(jié)構(gòu)完整等特點(diǎn)；體細(xì)胞胚可以固定F1代雜種優(yōu)勢(shì)；為一些不能采用種子繁殖的園藝作物開辟了良種繁育的新途徑。有機(jī)溶劑采用十六烷、油酸等對(duì)產(chǎn)物有大的分配系數(shù)的物質(zhì)。5) 生物反應(yīng)器培養(yǎng)的放大技術(shù)。 2)可以較容易地控制培養(yǎng)系統(tǒng)的理化環(huán)境，從而研究特定的代謝途徑，便于調(diào)節(jié)。同時(shí)，成批培養(yǎng)的周期短，一個(gè)培養(yǎng)周期后，細(xì)胞和培養(yǎng)液同時(shí)取出進(jìn)行目的產(chǎn)物的提取，下一個(gè)培養(yǎng)周期必須重新接種，因此增加了成本。Kossel 明確提出了植物次生代謝(secondary metabolism）的概念，認(rèn)為次生代謝是植物體利用某些初生代謝產(chǎn)物為“原料”，在一系列酶的催化下，形成一些特殊的化學(xué)物質(zhì)有別于初生代謝的一類特殊而復(fù)雜的代謝過程。 7)選育新型自交系8)遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料。優(yōu)點(diǎn)：可對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞連續(xù)進(jìn)行顯微觀察，了解一個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂、分化等過程。 2）用孔徑為200um的無(wú)菌網(wǎng)過濾，4000RPM/M離心，除去比單細(xì)胞小的碎片，獲得純凈的細(xì)胞懸浮液。：1)種間和屬間雜交。 低溫處理 4℃DNA合成受阻，細(xì)胞趨向G1期:1)基本培養(yǎng)基的組成:a氮 硝酸鹽是最常用的氮源。②選擇適宜的培養(yǎng)基：較高濃度；必要的附加物質(zhì)。 2)細(xì)胞生長(zhǎng)速度慢，易受微生物污染，有時(shí)需用抗生素；3)細(xì)胞生長(zhǎng)的中期及對(duì)數(shù)期，易凝聚為直徑達(dá)350 um一400 um 的團(tuán)塊，懸浮培養(yǎng)較困難； 4)培養(yǎng)時(shí)需供氧，培養(yǎng)液粘度大，不能耐受強(qiáng)力通風(fēng)攪拌；并具有群體效應(yīng)。4） 如果使處在靜止期的細(xì)胞懸浮液保持時(shí)間太長(zhǎng)，則會(huì)引起細(xì)胞的大量死亡和解體。2)特點(diǎn)：培養(yǎng)基體積固定；培養(yǎng)過程中，細(xì)胞生長(zhǎng)，其數(shù)目 不斷發(fā)生變化，呈S增長(zhǎng)。 4）細(xì)胞取得中微生物的去除；：1）研究細(xì)胞生理代謝過程及各種影響因子；2）用于植物品種的改良； 3）用于植物次生代謝物質(zhì)的生產(chǎn)。：1）外植體的發(fā)育階段→柱頭和花柱的影響；胎座的影響；外植體的生理狀態(tài)；2）培養(yǎng)基及授粉方式 White MS；3.）培養(yǎng)條件及培養(yǎng)前預(yù)處理 2025℃，弱光，低溫處理可能有利于某些未受精的胚珠與了房離體培養(yǎng)形成單倍體植株。方法：離體柱頭授粉、離體子房授粉、離體胚珠授粉2. 離體授粉的方法：.實(shí)驗(yàn)材料的選擇：選用子房大有多個(gè)胚珠的植物，如茄科、玉米多保留母體花器官組織有利于離體授粉成功。2）處于旺盛生長(zhǎng)期的胚乳，離體條件下最易誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，誘導(dǎo)率最高，可達(dá)9095% 。要分化必須選擇特定的激素和附加物。3）茄科：枸杞、馬鈴薯。胚乳的產(chǎn)生：被子植物雙受精后，受精卵發(fā)育成胚，受精極核發(fā)育成胚乳15. 胚乳培養(yǎng)的探討：1）胚乳培養(yǎng)的最早研究始于1933年，Lampe和Mills首例進(jìn)行了玉米胚乳培養(yǎng)。魚雷胚:葉綠色,展開的子葉大,苗發(fā)育較前兩時(shí)期好。主要原因?yàn)榕囵B(yǎng)基中成分不適宜:成熟胚→正常發(fā)育形成小苗未成熟胚→維持胚的生長(zhǎng)，進(jìn)行正常的胚胎發(fā)育成熟，完成胚胎發(fā)育的全過程8. 愈傷組織途徑: 激素濃度高 分化培養(yǎng)基離體胚 → 愈傷組織 → 胚狀體或不定芽→小植株9. 胚“ 早熟萌發(fā)”：離體的幼胚在培養(yǎng)基上不能長(zhǎng)出成熟胚的各種結(jié)構(gòu)，越過正常胚胎發(fā)生過程中的若干階段，直接長(zhǎng)成弱小的幼苗，只具有離體時(shí)已有的結(jié)構(gòu)。 2)打破種子休眠，縮短育種年限。 培養(yǎng)條件:低溫1)基因型與體細(xì)胞胚發(fā)生 2)植物激素與體細(xì)胞胚發(fā)生①