【正文】 影響；外植體的生理狀態(tài)；2）培養(yǎng)基及授粉方式 White MS；3.）培養(yǎng)條件及培養(yǎng)前預處理 2025℃，弱光，低溫處理可能有利于某些未受精的胚珠與了房離體培養(yǎng)形成單倍體植株。這樣可以使花粉管不經(jīng)過柱頭和花柱組織，直接進入子房中的胚珠，有可能克服孢子體不親和現(xiàn)象，從而獲得遠緣雜交種。方法：離體柱頭授粉、離體子房授粉、離體胚珠授粉2. 離體授粉的方法：.實驗材料的選擇：選用子房大有多個胚珠的植物，如茄科、玉米多保留母體花器官組織有利于離體授粉成功。類型：受精胚珠培養(yǎng)、未受精胚珠培養(yǎng)一）胚珠培養(yǎng)方法：：培養(yǎng)受精胚珠：從大田或溫室取回授粉時間合適的子房；培養(yǎng)未受精胚珠：取授粉前時間合適的子房；消毒后，用解剖刀沿子房縱軸切開，取出一個個胚珠（可帶胎座），接種。2）處于旺盛生長期的胚乳，離體條件下最易誘導產(chǎn)生愈傷組織，誘導率最高，可達9095% 。單子葉植物、雙子葉植物的離瓣花(schizopetalous flower)為核型胚乳。要分化必須選擇特定的激素和附加物。（2）胚胎發(fā)生途徑，在愈傷組織上直接生成胚狀體，后生成小苗。3）茄科：枸杞、馬鈴薯。5）胚乳細胞是研究淀粉、蛋白質(zhì)和脂類天然產(chǎn)物代謝途徑的理想系統(tǒng)。胚乳的產(chǎn)生：被子植物雙受精后，受精卵發(fā)育成胚，受精極核發(fā)育成胚乳15. 胚乳培養(yǎng)的探討：1）胚乳培養(yǎng)的最早研究始于1933年，Lampe和Mills首例進行了玉米胚乳培養(yǎng)。大麥離體胚，在含有異種胚乳的培養(yǎng)基中，對胚的生長促進作用更強。魚雷胚:葉綠色,展開的子葉大,苗發(fā)育較前兩時期好。次氯酸鈉：5%的次氯酸鈉處理10min用無菌水沖洗34次，即可用于胚的分離和培養(yǎng)。主要原因為培養(yǎng)基中成分不適宜:成熟胚→正常發(fā)育形成小苗未成熟胚→維持胚的生長，進行正常的胚胎發(fā)育成熟，完成胚胎發(fā)育的全過程8. 愈傷組織途徑: 激素濃度高 分化培養(yǎng)基離體胚 → 愈傷組織 → 胚狀體或不定芽→小植株9. 胚“ 早熟萌發(fā)”：離體的幼胚在培養(yǎng)基上不能長出成熟胚的各種結(jié)構(gòu)，越過正常胚胎發(fā)生過程中的若干階段，直接長成弱小的幼苗，只具有離體時已有的結(jié)構(gòu)。它培養(yǎng)容易成功,成熟胚材料不受季節(jié)性限制。 2)打破種子休眠，縮短育種年限。胚的發(fā)育包括：原胚時期球型胚心型胚魚雷胚成熟胚。 培養(yǎng)條件:低溫1)基因型與體細胞胚發(fā)生 2)植物激素與體細胞胚發(fā)生①內(nèi)源激素與體細胞胚發(fā)生 ②，4D與體細胞胚發(fā)生。合子胚在胚胎發(fā)育完全進入子葉期以后，經(jīng)過一系列的物質(zhì)積累和脫水就進入休眠。特別是那些發(fā)育初期類似于動物胚胎發(fā)育途徑的體細胞胚，這一點更為明顯。胚性細胞團特征：成簇、成團，體積小，細胞質(zhì)致密：體細胞胚發(fā)育再生植株有兩個明顯的特點。 遺傳性相對穩(wěn)定。特點:離體產(chǎn)物 起源于非合子胚 經(jīng)過胚胎發(fā)育過程3. 體細胞胚的產(chǎn)生花粉培養(yǎng)單細胞懸浮培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)組織器官培養(yǎng)體細胞胚花粉胚非合子胚非合子細胞合子胚無融合生殖胚 大多數(shù)植物組織培養(yǎng)，單細胞懸浮培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)中都觀察到體細胞胚胎發(fā)生或花粉胚胎發(fā)生（pollen embryogenesis） **前者為二倍體的體細胞產(chǎn)生的胚狀結(jié)構(gòu) **后者是由小孢子或其分裂產(chǎn)物等單倍體細胞產(chǎn)生的體細胞胚，通常稱花粉胚（pollen embryos），可發(fā)育成單倍體植株。：光照 包括光強、光質(zhì)和光周期。①不同植物類細胞脫分化和再分化所需糖濃度不同，多數(shù)植物種適宜糖濃度為26%；②培養(yǎng)目的不同要求糖濃度不同：誘導器官脫分化形成愈傷組織為3%6%，愈傷組織芽分化為3%6%，根分化為2%3%； ③培養(yǎng)方式不同對糖濃度的要求不同。一般規(guī)律是：細胞脫分化需要高濃度的2,4D，當胚性細胞形成轉(zhuǎn)入再分化時，則需較低的2,4D濃度。但兩者同時存在的用量比值可以改變形態(tài)建成方向。 器官發(fā)生方式:，再分化根；，再分化芽； 器官型外植體本身存在器官原基（莖尖、根尖）器官發(fā)生的解剖學:兩種途徑 器官發(fā)生型外植體→形成愈傷組織→器官原基及器官 形成4. 影響器官分化的因素:培養(yǎng)基成分：礦質(zhì)元素 有機成分 激素組合 環(huán)境條件：光照 溫度 濕度植株材料： 品種基因型的差異 材料的生理狀況培養(yǎng)基成分:礦質(zhì)元素及其他有機成分 礦質(zhì)元素促進器官發(fā)生； 糖維持培養(yǎng)基的滲透壓 提供碳源和能源5. 植物激素的應用規(guī)律:1）先生長素，后細胞分裂素，有利于細胞分裂，但細胞不分化。組織水平的再分化。防止玻璃化措施：增加瓊脂濃度。如維生素C等連續(xù)轉(zhuǎn)移。外植體的受傷程度。形成愈傷組織形成中心或者進一步分化成為維管組織。特征：是外層細胞進行分裂，而中間的細胞不分裂。受激素作用后，分裂前細胞的主要變化有:一、呼吸作用加強，消耗氧氣的量明顯增加。外觀一般是鮮艷的乳白或淡黃色，呈細小顆粒狀，松散易碎。3. 細胞脫分化與愈傷組織形成：細胞脫分化是細胞生理狀態(tài)的改變，脫分化細胞經(jīng)過連續(xù)的有絲分裂，形成愈傷組織。脫分化是分化的逆過程。：1）在細胞周期中運轉(zhuǎn)的細胞，屬周期細胞2）暫時脫離細胞周期的細胞，它們可在適當?shù)拇碳は轮匦逻M入細胞周期，進行增殖。（8）體細胞無性系變異是除有性雜交和理化誘變之外的第三個變異來源。（4）在遠緣雜交中，通過離體授粉或原生質(zhì)體融合有可能克服受精前障礙，在通過幼齡合子胚培養(yǎng)可以克服受精后障礙，通過體細胞融合還有可能制造出細胞質(zhì)雜種。(4)微繁技術(shù)得到廣泛應用。在有些植物任何部分都可以得到體細胞胚，如胡蘿卜和毛茛上。 ⑤1958年，Wickson和Thimann應用外源細胞分裂素可促成在頂芽存在的情況下處于休眠狀態(tài)的腋芽的生長。 ②1953～1954年，Muir進行單細胞培養(yǎng)獲得初步成功，對分離的單細胞進行了 “看護培養(yǎng)”。揭示了B族維生素和生長素的重要意義，1939年連續(xù)培養(yǎng)胡蘿卜根形成獲得首次成功。 3. Hannig 1904年在無機鹽和蔗糖溶液中培養(yǎng)了蘿卜和辣根菜的胚，并使這些胚在離體條件下長到成熟； 1925，1929年把由亞麻種間雜交形成的不能成活的種子胚剝出，培養(yǎng)至成熟，證明了胚培養(yǎng)在植物遠緣雜交中利用的可能性。GA3空間及物體表面滅菌：(1)紫外線滅菌(2)熏蒸滅菌：熏蒸劑:甲醛和高錳酸鉀。滅菌方法：將鍋內(nèi)空氣完全排除后，關(guān)閉放氣閥。大量無菌水沖洗化學方法:甲醛(福爾馬林)、過氧化氫、高錳酸鉀、來蘇兒、漂白粉、次氯酸鈉、升汞(氯化汞)、酒精培養(yǎng)基的滅菌－濕熱滅菌法：培養(yǎng)基在制備后的24h內(nèi)完成滅菌工序。常用的滅菌方法:物理方法:干熱滅菌(烘燒和灼燒)。(5)KM—8P培養(yǎng)基:它是1974年為原生質(zhì)體培養(yǎng)而設(shè)計的。特點：是成分較簡單，KNO3和（NH4）2SO4含量高，不含鉬。特點：是無機鹽離子濃度較高，有高含量的N、K，硝酸鹽量大，營養(yǎng)豐富。因此，沒有一種培養(yǎng)基能夠適合一切類型的植物組織或器官，在建立一項新的培養(yǎng)系統(tǒng)時，首先必須找到一合適的培養(yǎng)基，培養(yǎng)才有可能成功。大規(guī)模生產(chǎn)時可用自來水。 使用濃度：1—5g／L。 抗生物質(zhì)(antibiotic) ：種類：青霉素、鏈霉素、慶大霉素等。瓊脂的凝固能力除與原料、廠家的加工方式有關(guān)外，還與高壓滅菌時的溫度、時間、pH值等因素有關(guān)，長時間的高溫會使凝固能力下降，過酸過堿加之高溫會使瓊脂發(fā)生水解，喪失凝固能力。培養(yǎng)材料的支持物 瓊脂(agar)： 固體培養(yǎng)時最好的固化劑。 ③抑制根的分化。在促進生長方面，根對生長素最敏感。（4）氨基酸 (amino acide）：作用：是很好的有機氮源，可直接被細胞吸收利用。 使用濃度：—／L。一般用量為0．1—1．0mg／L。最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是較好的碳源。蔗糖使用濃度在2%—3%，常用3%，但在胚培養(yǎng)時采用4%15%的高濃度，因蔗糖對胚狀體的發(fā)育起重要作用。 [N、P、K、Mg、S和Ca等]。(4)細胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)細胞培養(yǎng)：將植物的單個細胞或細胞團分離出來，放在培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。其具體方法是將其取出放在液體或固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，由于胚包含在胚珠和子房里，因而進行胚胎培養(yǎng)時，常常是將胚珠和子房放在培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)的是什么器官，就稱為什么培養(yǎng)。離體培養(yǎng)條件下，細胞全能性的表達是通過細胞脫分化和再分化實現(xiàn)的。再分化的過程有兩種方式： 1）器官發(fā)生方式 2）胚胎發(fā)生方式 胚狀體再分化植物組織培養(yǎng)過程：植物體愈傷組織脫分化根、芽離體、消毒的植物器官、組織或細胞 脫分化：一個成熟細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚鸂顟B(tài)并形成未分化的愈傷組織的現(xiàn)象。1 鈣、鎂、硫參與細胞壁的構(gòu)成影響光合作用，促進代謝等生理活動二、組織培養(yǎng)的生理依據(jù)細胞全能性學說：植物體的每一個細胞都含有一個完整個體的全套基因，這些基因在適宜的外界條件下按照某種特定的程序先后表達，最終分化形成一個完整的植株，稱為細胞全能性（totipotency)全能性只是一種可能性。主要以銨態(tài)氮和銷態(tài)氮形式被利用。 愈傷組織：原義植物在受傷之后在傷口表面形成的一團薄壁組織；在組織培養(yǎng)中指在人工培養(yǎng)基上由外植體長出來的一團無序生長的薄壁細胞。無菌（asepsis ) ：使培養(yǎng)器皿、器械、培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料等處于無真菌、細菌、病毒等微生物的狀態(tài)，以保證植物材料在培養(yǎng)皿中正常生長和發(fā)育。由于培養(yǎng)的植物材料已經(jīng)脫離的母體，也稱植物離體培養(yǎng)。離體培養(yǎng)的材料，包括：器官、組織、細胞、原生質(zhì)體。氮還是葉綠素、維生素和植物激素的組成分。組織培養(yǎng)中鉀能促進器官和不定胚分化促進葉綠體ATP的合成，增強植物光合作用和產(chǎn)物的運輸，調(diào)解植物細胞的水勢，調(diào)解氣孔運動，提高抗逆性。一個單細胞再生完整植株的過程A：離體單細胞
BE：單細胞增殖成
愈傷組織
F：將愈傷組織在培
養(yǎng)基上繼代
G．促進愈傷組織分
化和增殖
H．誘導莖芽生根
I．再生植株移栽 全能性體現(xiàn)的兩個過程：一個已分化的細胞要表現(xiàn)它的全能性，必須經(jīng)歷兩個過程，即首先要經(jīng)歷脫分化過程，然后再經(jīng)歷再分化過程。繼代：植物組織培養(yǎng)過程中，外植體在培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時間以后需要轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。愈傷組織的形態(tài)發(fā)生途徑 : ①胚胎發(fā)生途徑； ②器官發(fā)生途徑(2)器官培養(yǎng)：器官培養(yǎng)是通過培養(yǎng)器官的類別來分類的。選用的外植體是成熟或未成熟的胚進行離體無菌培養(yǎng)。 。(5) 莖尖分生組織培養(yǎng)四、植物組織培養(yǎng)實驗構(gòu)建及操作技術(shù) 實驗室組成：緩沖室、準備室、溫室、馴化室、培養(yǎng)室、無菌操作室輔助實驗室基本實驗室 實驗室設(shè)置實驗準備,培養(yǎng)基的配制,洗滌與滅菌等準備室細胞學實驗室 生化分析室離體材料的無菌操作,又稱接種室準備室控制條件下的離體培養(yǎng)儀器設(shè)備和器皿用具常見儀器設(shè)備：超凈工作臺或接種箱空調(diào)除濕機或加濕器恒溫培養(yǎng)箱 高壓滅菌鍋 冰箱 天平 顯微鏡 水浴鍋 搖床與轉(zhuǎn)床1 蒸餾水發(fā)生器 1酸度計 1離心機接種器具：鑷子、剪刀、解剖刀等培養(yǎng)設(shè)備：培養(yǎng)箱、培養(yǎng)架等 細胞學鑒定設(shè)備：光學研究顯微鏡、實體顯微鏡、倒置顯微鏡 培養(yǎng)基及其配制（1） 、培養(yǎng)基的成分培養(yǎng)基組成：無機營養(yǎng)物、有機營養(yǎng)物、植物生長調(diào)節(jié)劑、碳水化合物、其它添加物 無機營養(yǎng)元素(inorganic element) ：1) 大量元素：／L的元素。麥芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在組織培養(yǎng)中也有應用。大規(guī)模生產(chǎn)時，可用食用的綿白糖代替。主要有VBl(鹽酸硫胺素)、VB6(鹽酸吡哆醇)、Vpp(煙酸)、Vc（抗壞血酸）、有時還使用生物素、葉酸、VB12等。Vc有防止組織變褐的作用。對組織和細胞的繁殖、分化有促進作用，對細胞壁的形成也有作用。有機附加物 （天然復合物）1)椰乳：濃度10%—20% 2)香蕉：150200ml／L 3)馬鈴薯(potato) ：150—200g／L4)水解酪蛋白：濃度100—200mg／L 5)其他：酵母提取液(YE)(%%)，主要成分為氨基酸和維生素類；麥芽提取液(%～%)植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)(hormone)（1）生長素類：作用：主要被用于誘導愈傷組織形成；促進細胞脫分化；促進細胞伸長；促進生根。②誘導芽分化，促進側(cè)芽萌發(fā)，使莖增粗，抑制莖伸長。赤霉素和生長素協(xié)同作用，對形成層的分化有影響：當生長素／赤霉素比值高時有利于木質(zhì)部分化，比值低時有利于韌皮部分化。瓊脂能溶解在熱水中，成為溶膠，冷卻至40 ℃即凝固為固體狀凝膠。缺點:培養(yǎng)物與培養(yǎng)基的接觸(即吸收)面積小，各種養(yǎng)分在瓊脂中擴散較慢，影響?zhàn)B分充分利用，同時培養(yǎng)物排出的代謝廢物，聚集在吸收表面，對組織產(chǎn)生毒害作用。活性炭(active carbon) ：目的：是利用其吸附能力，減少一些有毒物質(zhì)的影響；利于生根。注意：用蒸餾水，最好是重蒸餾水；以保持培養(yǎng)基成分的精確性。在離體培養(yǎng)條件下，不同種植物的組織對營養(yǎng)有不同的要求，甚至同一種植物不同部位的組織對營養(yǎng)的要求也不相同。是目前應用最廣泛的培養(yǎng)基。N6培養(yǎng)基：1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)而設(shè)計的。特點：是含有較低的銨鹽，較高的硝酸鹽和鹽酸硫胺素。滅菌:是指用物理或化學的方法，殺死物體表面和孔隙內(nèi)的一切微生物或生物體，即把所有生命的物質(zhì)全部殺死。過濾除菌。在此蒸氣溫度下，可以很快殺死各種細菌及其高度耐熱