【正文】 的蛋白質(zhì)組份 表 雞蛋清中一些蛋白質(zhì)用 CM纖維素分離結(jié)果的分析 級分中的蛋白質(zhì) pI 洗脫緩沖液的pH 洗脫峰 pH 產(chǎn)量（ mg） 活性回收（ %） A．擬卵粘蛋白 87 B．擬卵粘蛋白 C．卵蛋白 A1 89 D．卵蛋白 A2 E．卵蛋白 A3 F．“球蛋白” G．卵轉(zhuǎn)鐵蛋白 87 H．卵轉(zhuǎn)鐵蛋白 I．“球蛋白” J．“球蛋白” K．“球蛋白” L．抗生物素蛋白 10 39 M．“球蛋白” N．溶菌酶 92 三、凝膠過濾層析 (exclusion chromatography) 凝膠層析又稱分子篩過濾、排阻層析等，依據(jù)是 多孔的載體對不同體積和不同形狀分子的排阻能力的不同 ， 從而對混合物進行分離。 一般物質(zhì)的 Kd值是 0Kd l。 911 150030000 50010000 6 2 9810(100) Sephadex G75 中粗 超細 40120 1040 177。 較常用的是 Pharmacia和 BioRad兩家的產(chǎn)品，前者生產(chǎn)的稱為 Sephacryl ，后者的產(chǎn)品為BioGel P。 保存 ? 液相中保存：于凝膠懸液中加入 防腐劑 或 高壓滅菌 后 4℃ 保存。 天花粉毒蛋白的凝膠過濾分離 交聯(lián)葡聚糖凝膠 G50柱 ( 100 cm)用 50m mol/LTrisHCl, pH 天花粉硫酸銨糊 (90％飽和度的沉淀 )溶于 2m1平衡緩沖液中 上樣 洗脫天花粉毒蛋白 除去不溶物 ↓ ↘ ↘ ↓ 測定高分子物質(zhì)的分子量 測 大于 所用載體 上限 分子的洗脫體積 測 小于下限 的分子的洗脫體積 標定凝膠過濾柱的 Vo 標定凝膠過濾柱的 Vi 測定一系列 已知分子量的標淮樣品 在柱上的洗脫體積 Ve 以 (VeVi)／ (VoVi)和1ogMw 作圖 測得了 待測分子量的樣品的 Ve 從 標準曲線上 可以 求得 未知樣品的分子量 藍色葡聚糖 氨基酸、有色鹽類 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 以標準樣品的分子量的 1ogMw對 Ve作圖 or 洗脫液中蛋白質(zhì)濃度 高分子溶液的濃縮 將 SephadexG25或 50干膠 投入到 稀的高分子溶液 中 水分和低分子量的物質(zhì)就會進入凝膠粒子內(nèi)部 高分子物質(zhì)則排阻在凝膠顆粒之外 離心或過濾 ，去除溶脹的凝膠 濃縮 的高分子溶液 ↓ 蛋白質(zhì)復(fù)性研究 變性蛋白加入凝膠柱 高濃度變性劑存在，蛋白呈無規(guī)則卷曲 變性蛋白 體積大，只能 進入顆粒間隙 ，遷移速度快 變性劑 分子量小，進入顆粒內(nèi)部 ，遷移速度慢 緩沖液洗脫蛋白 變性劑濃度降低， 轉(zhuǎn)成復(fù)性緩沖液 變性蛋白 復(fù)性 ，以 天然形態(tài)洗脫出柱 ↓ ↓ 四、疏水層析 (hydrophobic chromatography，HIC) （一）原理 疏水作用層析 （ HIC） 是根據(jù) 分子表面疏水性差別 來分離蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子的一種層析方法。 乙醇或去污劑的非極性區(qū)與結(jié)合的蛋白質(zhì) 競爭疏水性配基 ，從而將蛋白質(zhì)替代下來。 可避免蛋白質(zhì)變性 缺點： 較長的時間、較大的洗脫條件。 特點： 高壓、高效、高速，高沸點、熱不穩(wěn)定有機及生化試樣的高效分離分析方法。 c. 示差折光檢測器 （ differential refractive index detector） 除紫外檢測器之外應(yīng)用最多的檢測器； 可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數(shù)差值 。 固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和全多孔型固定相兩類。 流動相組成改變 ， 極性改變 ， 可顯著改變組分分離狀況； （ 2） 親水性固定液常采用疏水性流動相 ， 即流動相的極性小于固定相的極性 ， 稱為正相液液色譜法 ， 極性柱也稱正相柱 。 也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時間縮短。 （ 4）化學(xué)穩(wěn)定性好 （ 5） 低粘度（粘度適中） 若使用高粘度溶劑，勢必增高壓力，不利于分離。支持介質(zhì)的作用主要是防止電泳過程中的對流和擴散，以使被分離的成分得到最大分辨率的分離。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。 CH2=CH C=O NH2 丙烯酰胺 N, N’甲叉 雙丙烯酰胺 CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH 聚丙烯酰胺 CH2CH C=O NH2 CH2CH C=O NH CH2 NH C=O CH2CH CH2175。 （ 2） 低溫、低 pH都會減慢聚合反應(yīng)速度。 在濃度為 % 的凝膠中，大多數(shù)生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)能得到滿意的分離效果。 4） 在電場中形成不連續(xù)的電位梯度。 對于一個未知樣品，常用 %的標準膠或 4%10% 的凝膠梯度來測試，而后選出適宜的凝膠濃度。 2. 凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系 凝膠的物理性質(zhì)如機械強度、彈性、透明度和粘著度都取決于凝膠總濃度（ T）和 Acr與 Bis兩者之比。微量 TEMED的加入，可促使過硫酸銨形成自由基： S2O82 2?SO4 這些自由基的產(chǎn)生可引發(fā)丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的聚合、交聯(lián)反應(yīng)，形成有一定平均孔徑的聚丙烯酰胺。其分辨率較高。 一、概述 （二）分類 按支持介質(zhì)種類的不同，區(qū)帶電泳可分為： ① 紙電泳：用濾紙作為支持介質(zhì)，多用于核苷酸的定性定量分析。 第五節(jié) 蛋白質(zhì)的電泳分離 一、概述 二、 PAGE凝膠電泳 三、 SDSPAGE凝膠電泳 四、聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳 五、雙向電泳 六、毛細管電泳 電泳的概念 ： 帶電物質(zhì)在電場中向相反電極移動的現(xiàn)象稱為電泳（ electrophoresis）。 由于高效液相色譜中流動相是液體，它對組分有親合力，并參與固定相對組分的競爭，因此，正確選擇流動相直接影響組分的分離度。 組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反 。 這類固定相的多孔層厚度小 、 孔淺 ， 相對死體積小 ， 出峰迅速 、 柱效亦高；顆粒較大 ， 滲透性好 ， 裝柱容易 ， 梯度淋洗時能迅速達到平衡 ， 較適合做常規(guī)分析 。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。 ?為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（ 10μm），液體的流動相高速通過時，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。 配體結(jié)合較強時 適當?shù)?pH、離子強度洗脫 ，注意盡量不影響待分離物質(zhì)的活性 與配體結(jié)合非常牢固時 使用較強的 酸、堿 或在洗脫液中加入 脲、胍等變性劑 ，使蛋白質(zhì)等待分離物質(zhì)變性，洗脫后再復(fù)性 吸附劑的再生和保存 再生 用 大量 的洗脫液或 較高濃度 的鹽溶液洗滌，再用平衡液重新平衡 嚴重的不可逆吸附時，使用 高濃度的鹽溶液、尿素等變性劑 或加入適當?shù)?非專一性蛋白酶 保存 加入 %的疊氮化鈉， 4176。 親和力 生物分子間存在很多特異性的相互作用，如抗原 抗體、酶 底物或抑制劑、激素 受體等，它們之間都能夠 專一而可逆 的結(jié)合。 影響疏水作用的因素： 蛋白質(zhì)的疏水性、蛋白質(zhì)的環(huán)境 Water molecules Solute Surface exposed hydrophobic groups Ligand Water molecules in bulk （二）疏水基質(zhì) 人工合成聚合物類 瓊脂糖 纖維素 聚苯乙烯 聚丙烯酸甲酯類 多糖類 殼聚糖 應(yīng)用最廣泛 良好的生物相容性和化學(xué)穩(wěn)定性 （三）疏水配基 烷基鏈配基 芳基配基 高分子配基 柱： HiPrep 16/10 樣品 : 細胞色素 C(1)，溶菌酶（ 2），核糖核酸酶（ 3）， 靡蛋白酶原（ 4） （四）基本操作 ?平衡 Equilibration ?上樣 Sample application ?洗雜 Washing ?洗脫 Elution Equilibration 1. Equilibration 2. Sample application 3. Washing 4. Elution Water molecules Hydrophobic ligand Gel matrix Sample application 1. Equilibration 2. Sample application 3. Washing 4. Elution Gel matrix Proteins Hydrophobic groups Washing out unbound material 1. Equilibration 2. Sample application 3. Washing 4. Elution Conc. salt Abs Nonbound proteins 1. Equilibration 2. Sample application 3. Washing 4. Elution Elution Target elutes Conc. salt Abs Elution 1. Equilibration 2. Sample application 3. Washing 4. Elution Conc. salt Abs More strongly bound proteins 層析柱的選擇 柱床高度通常為 5～ 15cm 對一個優(yōu)化好的分離方案進行 規(guī)模放大 時，可保持柱高不變， 增加柱的直徑 粗柱子（內(nèi)徑為 ～ ）適合進行 HIC層析。 ? 干燥狀態(tài)保存：長期不用，水洗凈后，用含乙醇的水洗，逐漸加大乙醇用量，最后用 95%的乙醇 洗，干燥后常溫保存。 可選用 Sephadex G25和 G50 小肽和低分子量的物質(zhì)（ 10005000）的脫鹽可使用 Sephadex G10， G15及 BioGelp2或 4。 1520 4000150000 1000100000 48 5 3434(35) Sephadex G150 中粗 超細 40120 1040 15177。 ?凝膠 交聯(lián)度 ?凝膠 顆粒大小 流速 過低 樣品橫向擴散增大， 峰變寬 ，分辨率降低，洗脫時間長 流速 過高 洗脫 峰重疊 ，柱壓增大，分離效果變差 線性流速控制在 2～ 10cm/h ② 加樣體積 體積 過大 平臺洗脫峰或相鄰 峰重疊 體積過小 目的蛋白 收集量少 、稀釋倍數(shù)大、 濃度低 ③ 樣品濃度 進樣前，樣品應(yīng) 高度濃縮 ，濃度為 10～ 20mg/ml 分組分離 amp。 大分子 物質(zhì)沿凝膠顆粒間隙隨洗脫液移動，流程短，移動速率快，先被洗出 層析柱 小分子 物質(zhì)可通過凝膠網(wǎng)孔進入顆粒內(nèi)部，然后再擴散出來，故流程長，移動速度慢，最后被洗出層析柱 體積參數(shù) 分子在柱中移動的速度取決于該分子在固定相和流動相間的分配系數(shù) Kd， Kd表示某一分子在特定的凝膠柱內(nèi)的洗脫行為。 ?對于疏水性污染物 乙醇溶液（如 70%的乙醇）或非離子型的去污劑洗滌 可以除去脂類和其他的疏水性物質(zhì)。 采用離子強度較大的梯度洗脫 選用 粗而短 的柱子為宜。 Dowex 強陰離子交換劑 交聯(lián)度為 4% 顆粒度為 50100目 其他 聚乙烯醇 DEAEToyope