氨基酸組成分析ppt課件(完整版)
【正文】 10℃ 保溫 22h。 1941年， Martin等運(yùn)用色層法分析氨基酸，主要采用乙酰 化氨基酸在硅膠柱上或?yàn)V紙上半定量；隨后， Moore、 Stein應(yīng)用離子交換柱直接分離游離的氨基酸，在 1958年， Spackman、 Stein、 Moore制造了自動(dòng)化的氨基酸分析 儀，使氨基酸定量分析進(jìn)入了一個(gè)嶄新的階段，至今仍是 經(jīng)典的方法。 第一節(jié) 氨基酸組成分析的目的 現(xiàn)代分離提純技術(shù)的發(fā)展使蛋白質(zhì)操作微量化，但也給 定量帶來(lái)了困難，一般很難通過(guò)常規(guī)的稱(chēng)量或測(cè)蛋白質(zhì)溶液 在 280nm的光吸收值來(lái)準(zhǔn)確定量蛋白質(zhì)。其中，苯酚是作為一種抗氧化劑來(lái)防止半胱氨酸 (Cys)和甲硫氨酸 (Met)的氧化。 這些添加劑包括琉基乙酸和 β琉基乙醇，我們通過(guò)實(shí)驗(yàn) 認(rèn)為液相水解時(shí)加入巰基乙醇對(duì) 色氨酸 保護(hù)效果較好，色氨 酸的回收可達(dá) 80％。 雖然蛋白質(zhì)和多肽的氨基酸分析法對(duì)大多數(shù)氨基酸是快速、準(zhǔn)確和靈 敏的，但在半胱氨酸定量時(shí)仍遇到很大困難，解決這個(gè)問(wèn)題的途徑有兩 種，一種是還原烷化法，另一種是氧化法。另外，在膜上做氨基酸 組成分析時(shí)可以做一個(gè)空白對(duì)照，具體操作時(shí)將含蛋白條帶的 PVDF膜 割下，另取一條相同面積的轉(zhuǎn)移膜作為空白，分別置于水解指管中 ,加入 70181。 (1)茚三酮法 Spackman等人最早將茚三酮試劑運(yùn)用到氨基酸組成分 析上。 0PA/FMOC作為柱前衍生劑能同時(shí)與一級(jí)胺和二級(jí)胺反應(yīng)，室溫下只 需幾分鐘， Hewlett Packard公司改用巰基丙酸 (3MPA)引代替巰基乙 醇。水解時(shí)間、水解溫度、真空度、樣品是否被氧化等，都影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果； 二是氨基酸的有效的衍生情況； 三是氨基酸色層分離好壞。食品和飼料中氨基酸分析采 用上述兩種方法均可。 (4)PTCAA分析法 屬柱前衍生法，源于 Edman降解法測(cè)定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié) 構(gòu)。目前此法的靈敏度可 達(dá) 100pmol，但茚三酮試劑易氧化，必須隔絕空氣避光保 存，試劑本身黏性大，需要有個(gè)柱后混合器才能與氨基酸充 分反應(yīng)，對(duì)儀器要求較高。 l含 7％巰基 乙酸的 6mol/L鹽酸， 110℃ 真空水解 24h，水解結(jié)束后用 200181。烷化試劑包括 4— 乙烯
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