單克隆抗體技術(shù)ppt課件(完整版)
【正文】 噬菌體抗體庫技術(shù) 1990年 Mc Cafferty等成功地建立了 噬菌體表面展示系統(tǒng) ，通過將抗溶菌酶單鏈抗體基因克隆于 fd噬菌體基因 3的下游，使 ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌體表面，利用親和層析，兩輪富集達 106倍。可規(guī)?；a(chǎn) 。 噬菌體抗體庫技術(shù)的發(fā)展具有很大優(yōu)越性。 噬菌體表面展示系統(tǒng) (phage surface display system ) 噬菌體表面展示文庫技術(shù)的要點 : 外源基因表達多肽以融合蛋白形式展示在外殼蛋白 N端 將基因組合文庫插入噬菌體編碼膜蛋白的基因 g3或g8 的先導(dǎo)系列的緊靠下游 隨機克隆入相應(yīng)載體形成組合文庫 從免疫或未被免疫的 B細胞中 PCR擴增抗體全套基因片段 用固相化抗原經(jīng) “ 親和結(jié)合一洗脫一擴增 ” 數(shù)個循環(huán)直接、方便、簡捷、高效地篩選出表達特異性好、親和力強的抗體噬菌體庫。 PCR技術(shù) 。 1種為對應(yīng)腫瘤相關(guān)抗原。但產(chǎn)量不及前者，一般實驗室培養(yǎng)條件下每升細菌的產(chǎn)量僅在數(shù)毫克左右。 連接肽 的長度在 1015個氨基酸左右，不宜太長或太短，它應(yīng)具有柔軟性，側(cè)鏈少，抗原性弱等特點。 不含 Fc，沒有 Fc帶來的效應(yīng) 。（美國正式上市的 11種治療性單抗中多數(shù)是改型抗體） 人源化抗體的構(gòu)建可用 全合成法 或 定點突變法 。 構(gòu)建重組表達載體 克隆鼠單抗的可變區(qū)基因，可從 基因組文庫 中分離，也可用 PCR技術(shù) 分離。 ? 可靠的篩選方法須在融合前建立，避免由于方法不當(dāng)貽誤篩選時機。 癌細 胞 可培 養(yǎng) 生 長 漿 細 胞 B cell 可分泌抗體 融 合瘤 Hybridoma Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y 細 胞 融 合 兩組 染色體混在一起 也可以培 養(yǎng) 生長 產(chǎn) 生 專 一性抗 體 一 個 B cell 只 產(chǎn) 生一 種 抗 體 細胞 DNA合成途經(jīng) ：次黃嘌呤（ H） HGPRT ： 氨 基 酸 鳥嘌呤核苷酸 谷 氨 酰 胺 （ A） 尿核苷單磷酸 胸腺嘧啶核苷酸 TK ：胸腺嘧啶核苷（ T） m 核酸補救合成 m 核酸從頭合成 核酸 氨甲喋呤 (A) () 次黃嘌呤 (H)\胸苷 (T) TK HGPRT TK HGPRT HAT選擇培養(yǎng)基的原理 ? HAT選擇培養(yǎng)基組分 次黃嘌呤（ hypoxanthine,H) 氨甲喋呤（ aminopterin,A):葉酸拮抗劑 胸腺嘧啶核苷（ thymidine,T) 抗原免疫的脾細胞 小鼠骨髓瘤細胞 （ B細胞） （ B細胞惡性腫瘤） 1. 抗體分泌（ Ig+) +在 HAT生長 HGPRT株 PEG 融合 HAT篩選 脾 骨髓瘤細胞（雜交瘤細胞） （ HGPRT+、 Ig+） 融合的結(jié)果及命運 雜交瘤細胞 未融合的脾細胞 未融合的骨髓瘤細胞 脾 脾雜交細胞 骨髓瘤 骨髓瘤雜交細胞 免疫動物 培養(yǎng)骨髓瘤細胞
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