【正文】 maximum signaltonoise performance. Figure 10. Depiction of single photon counting. The signal is detected by the PMT, emerging as a pulse which is then amplified. If the magnitude of the amplified pulse exceeds a certain threshold, it is passed through the discriminator and counted as a signal. Smaller pulses due to noise and dark current are much more likely to be rejected, thereby increasing signaltonoise. Spectrofluorometers offer the most flexibility for quantitative and qualitative applications. Many instruments are modular so that monochromators can be replaced with filters in the emission or excitation beams if desired. 主要譜參量 激發(fā)譜和發(fā)射譜 熒光光譜包括激發(fā)譜和發(fā)射譜兩種 。 the energy is transferred as heat to the surroundings. ? In some cases light is emitted by the sample either as fluorescence or phosphorescence. ? We will discuss the general characteristics of emission and ignore the exceptions. 熒光光譜的特點 Barak and Webb demonstrated that as few as 30 fluorescent dye molecules bound to low density lipoprotein molecules can be detected on cell surfaces by microscopy using a sensitive video camera. With even more sophisticated methods others have moved toward detection of single fluorophore molecules in a laserexcited flow stream. Because this sensitivity can bine with ease of use and the potential for multiparameter analysis, fluorescence has bee widely used in biology and medicine. Fluorescence is a sensitive technique for detecting biological materials 熒光光譜靈敏度高的原因 熒光輻射的波長比激發(fā)光波長長 ， 測量到的熒光頻率與入射光的頻率不同； 熒光在各個方向上都有發(fā)射 ， 因此可以在與入射光成直角的方向上檢測； 這樣 ， 熒光不受來自激發(fā)光的本底的干擾 ，靈敏度大大高于紫外 可見吸收光譜 ， 測量用的樣品量很少 ， 且測量方法簡便 。 我們這里要介紹的熒光 ， 是指物質在吸收紫外光和可見光后發(fā)出的波長較長的紫外熒光或可見熒光 。 激發(fā)態(tài)的壽命取決于輻射與非輻射之間的競爭 。 熒光壽命 (fluorescence lifetime) 去掉激發(fā)光后 ， 分子的熒光強度降到去掉激發(fā)光時熒光強度 I0的 1/e所需要的時間 ， 稱為熒光壽命， 常用 ?表示 。 ?F表示熒光分子的固有熒光壽命 ， kF表示熒光發(fā)射速率的衰減常數(shù) 。 量子產率 (quantum yield) 熒光量子產率是物質熒光特性中最基本的參數(shù)之一 ， 它表示物質發(fā)射熒光的效率 。 量子產率的改變必然會引起熒光強度的改變 。Z 式中 ? (?A)為激發(fā)波長 ?A處的消光系數(shù)， Ｃ 為樣品分子的濃度， I0為入射光強度， I0為透過樣品后的光強度， L為光程（樣品池光徑） 如果激發(fā)光強保持不變，且 ?和 Z與激發(fā)波長無關，則 F? ?(?A) 很顯然，熒光強度與樣品在波度 ?A處的消光系數(shù)有關，而消光系數(shù)與激發(fā)波長是密切相關的，消光系數(shù)隨波長的變化即吸收譜，因此熒光強度也隨激發(fā)波長的變化而變化。 電偶極子發(fā)射的熒光在與電偶極子方向垂直的方向上最強 （ 即熒光傳播方向與電偶極子方向垂直的熒光最強 ） ， 在與電偶極子平行的方向上最弱 。 由于單色器和光電倍增管等對垂直和水平兩個偏振成分的敏感度可能不同，因而嚴格的測定需要引入校正因子 G，定義 G為水平偏振光激發(fā)樣品時，儀器對垂直偏振光的透射效率與對水平偏振光透射效率之比，為 G?IHV/IHH IHV為起偏器水平取向而檢偏器垂直取向時測得的熒光強度 ， IHH為起偏器和檢偏器均為水平取向時測得的熒光強度 。 但正因為其靈敏度高 ， 因此也容易受到各種因素的干擾 。 介電常數(shù)?不僅與偶極子取向有關 ， 也與電子取向有關 ， 上式中第一項 (???)/(2???)是電子和偶極子重新取向的結果；折射率 n與電子重新分布有關 ， 因此上式中第二項是電子重新分布的結果 。 例如 ，當溶劑的極性由乙二醇 、 甲醇 、 異丙醇到辛醇依次減小時 ， ANS（ 1氨基 8萘磺酸酯 ， 一種熒光探針 ， 常用于與蛋白質非共價結合 ） 的熒光譜發(fā)生蘭移 ， 量子產率提高 。 利用這種效應 ， 可以將其熒光波長作為 pH值的指示劑 。 一種可能的機制是：在非極性的溶劑中系間交連 （ 轉移到另外的激發(fā)態(tài) ）的速率會減少 。 如果溶液中有淬滅劑存在 ， 則淬滅劑的作用也會隨溫度升高而增大 。 對于濃度淬滅產生的原因最簡單的解釋是：激發(fā)態(tài)分子在發(fā)出熒光之前就和未激發(fā)的熒光物質分子碰撞而自淬滅 。 雜質對量子產率 （熒光強度）的影響 除熒光分子之外的其它分子與熒光分子的相互作用使熒光量子產率減少的現(xiàn)象統(tǒng)稱為雜質淬滅 。 只有在低溫下， 由三線態(tài)返回基態(tài)而放出波長的磷光 。 氧在弱極性溶劑中的溶解度比較高 ， 例如氧在乙烷中的溶解度約為在水中的幾倍 。 溶液粘度對熒光強度的影響 熒光強度一般隨介質粘度的升高而增強 。 這種現(xiàn)象不是由于二聚體的形成 ， 而是由于自吸收 。絕大多數(shù)熒光物質含有芳香環(huán)或雜環(huán) 。 熒光探針 總的來說，天然的熒光生物分子種類很有限，而且熒光強度較弱，為了研究多數(shù)的不發(fā)光的生物分子，人們廣泛利用一類能產生穩(wěn)定熒光的分子，把這些小分子和大分子結合起來，或者插入大分子中，根據(jù)這些較小的熒光分子性質的改變，分析大分子的結構，這類小分子稱為熒光探針。 維生素 B12在 pH7的溶液中 ， 可以用 275nm激發(fā) ， 305nm處檢測 。 因此 ， 可以利用熒光強度的變化估算出光合效率的高低 。這種測定生色團距離的方法 ， 常被人稱為光譜尺 。 表明隨作用時間的增加 ， 該蛋白質逐漸變性 ， 發(fā)生去折疊 ， 蛋白質內部的熒光生色團逐漸暴露在極性水環(huán)境中 。 植物 、 藻類或光合細菌中含有各種色素和輔助色素分子 ， 包括葉綠素 a、 b、 c c2， 類胡蘿卜素如 ?胡蘿卜素 、 巖藻黃質 、 多甲藻黃素 ，藻膽素如藻藍素 、 藻紅素等 ， 都含有熒光生色團 ， 它們的熒光激發(fā)譜和熒光發(fā)射譜都可用來鑒定色素的存在及含量 ， 也可以用來分析光合作用過程中能量的吸收與傳遞 。 ?探針與被研究分子的某一微區(qū)必須有特異性的結合 ， 而且結合得比較牢固 。 ? 分子的幾何排布：具有剛性平面結構的有機分子容易發(fā)熒光 。 分子內環(huán)境與熒光壽命 生色團在分子內的環(huán)境也會影響熒光壽命 ，正是由于這個原因 ， 熒光壽命才被用來分析分子內不同的生色團所處的環(huán)境 。 例如熒光物質 TNS在不同濃度的蔗糖水溶液中 ， 熒光強度隨粘度增加而增加 。 Ⅴ. 共振能量轉移：（略） 總的來說 ， 為克服雜質淬滅帶來的問題 ，對所使用的溶劑或緩沖液 ， 首先要考慮其對所使用的熒光物質是否有直接作用 。 某些淬滅劑分子與熒光物質分子相互作用時會發(fā)生電子轉移反應 ， 即氧化 ?還原反應 ， 從而引起熒光淬滅 。 例如中性的 M磷酸緩沖液能淬滅酪氨酸的熒光 。 產生濃度淬滅的另一個重要原因之一是：當溶液較濃時 ， 激發(fā)光一進入溶液 ， 就被靠近光源一側的樣品池壁的熒光分子大量吸收 ， 這樣 ， 越進入溶液 ， 發(fā)熒光分子越少 ， 因而大量的激發(fā)光在到達池中心之前就被吸收了 。 樣品濃度對熒光強度的影響 在樣品濃度較低時 ， 熒光強度與熒光物質的濃度成正比 。 尤其是對于稀溶液來說 ， 光化分解就更為嚴重。 當蔗糖濃度由 10%增加到60%， 粘度從 58分泊 ， ?max從580 nm蘭移到 555 nm。 例如 ， 如果在激發(fā)態(tài)的壽命之內 ， 分子沒有足夠的時間來重新排列并降低激發(fā)態(tài)的能量 ， 則可能發(fā)生 ? max 蘭移的情況 。 而在極性溶劑中 ?a??f 較大 ， 產生紅移 。有時 ， 為了得到可靠的結果 ， 實驗設計和操作中需要考慮和設法減少這些因素的影響；有時 ， 也可巧妙地利用熒光參數(shù)對環(huán)境困素的敏感性來達到我們的目的 。 經(jīng)校正后的熒光偏振度 Ｐ ?(IVV?GIVH)/(IVV+GIVH) 定義 不對稱度 (或熒光 各向異性， anisotropy factor) A?(I‖?I?)/(I‖+2I?) (I‖+2I?)表示發(fā)射光的全部，包括平行于入射光方向上的以及與入射光軸垂直的兩個方向上的分量。 在分子朝向無規(guī)律但分子不能自由運動的溶液中 ，Ｐ的值稱為本征極化率 P0。 當然，實際上儀器因子 Z與波長是有關的，這就使得激發(fā)譜與吸收譜并不完全相似。 熒光強度 熒光強度 F取決于激發(fā)態(tài)的初始分布 IA與量子產率 ? 的乘積 。 發(fā)射量子數(shù) ? ? ????? 吸收量子數(shù) ?的絕對值是較難用實驗的方法測量的 ， 因為必須事先知道儀器的修正因子 。 壽命 ?和這些過程的速率常數(shù)有關 ， 總的退激過程的速率常數(shù) k可以用各種退激過程的速率常數(shù)之和來表示 : k?kF+?ki ki表示各種非輻射過程的衰減速率常數(shù) 。 假定在時間 ?時測得的 It為I0的 1/e， 則 ?是我們定義的熒光壽命 。 例如 ， 生色團及其環(huán)境的變化過程在紫外可見吸收的 1015秒的過程中基本上是靜止不變的 ， 因此無法用紫外可見吸收光譜檢測 ， 但可以用熒光光譜檢測 。 ?In discussing absorption we have been concerned entirely with the excitation of a molecule from its ground state to a higher energy level and have given no consideration to the subsequent fate of the excited molecule. ? In many cases the sequel is not very interesting。 除了紫外光和可見光可能激發(fā)熒光外 ， 其它的光如紅外光 、 X射線也可能激發(fā)出熒光 ， 因此除紫外熒光或可見熒光外 ， 還有紅外熒光 、 X射線熒光等 。由于熒光有一定的壽命 ， 因此可以檢測一些時間過程與其壽命相當?shù)倪^程 。 如熒光強度的衰減符合指數(shù)衰減的規(guī)律 : It?I 0ekt 其中 I0是激發(fā)時最大熒光強度 ， It是時間 t時的熒光強度 ， k是衰減常數(shù) 。 處于激發(fā)態(tài)的分子 ， 除了通過發(fā)射熒光回到基態(tài)以外 ，還會通過一些其它過程 (如淬滅和能量轉移 )回到基態(tài) ，其結果是加快了激發(fā)態(tài)分子回到基態(tài)的過程 (或稱退激過程 )， 結果是熒光壽命降低 。 熒光量子產率通常用 ?來表示 ， 定義為發(fā)射量子數(shù)和吸收量子數(shù)之比 ， 即由熒光發(fā)射造成的退激分子在全部退激分子中所占的比例 ， 又稱為熒光效率 。 因此 ， 如果只需要研究量子產率的相對值 ，則只要量測熒光強度也就足夠了 。激發(fā)譜與吸收譜呈現(xiàn)正相關關系。 溶液中的分子 ， 其分布是隨機的 ， 而且從吸收到發(fā)射的時間之內 ， 分子本身已經(jīng)產生了轉動 ， 因此熒光偏振的程度將減小 ， 所以熒光偏振又常稱為熒光消偏振或熒光去偏振 。 儀器不同 ， 波長不同 ， Ｇ值都可能不同 ，