理學(xué)酶工程ppt課件(完整版)
【正文】 機(jī) 2022/3/13 10 離子交換濃縮 超濾 凝膠干燥 → 濃縮 → 分離 → 純化 → 酶的結(jié)晶 粗提酶液 → 脫鹽 凝膠過濾 透析 離子交換層 析 凝膠色譜層 析等 親和層析 等電聚集等 一種新型的微生物酶純化手段 —— 制備型聚丙烯酰胺凝膠電泳 (未被廣泛應(yīng)用于酶的制備 ) 酶的生產(chǎn)及分離純化 2022/3/13 11 性質(zhì) 方法 ?分子大小 透析、超濾、差速離心、凝膠過濾 ?溶解度 等電點沉淀、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀 ?電荷 電泳、離子交換層析 ?吸附性質(zhì) 吸附層析 ?對配體分子 的生物親和力 親和層析 酶分離純化常用方法 2022/3/13 14 （ 1）酶分離的沉淀技術(shù) 1）鹽析 ——— 溶解度的差異 ? 向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽[（ NH4)2SO4， Na2SO4， NaCl]，當(dāng)溶液的離子強(qiáng)度增加到一定數(shù)值時，蛋白質(zhì)溶解度開始下降。 PEG沉淀法能在室溫下進(jìn)行，得到的沉淀顆粒較大，收集容易。 一般用于酶的粗分離。 ? 帶有正電荷的稱之陰離子交換樹脂；而帶有負(fù)電荷的稱之陽離子樹脂。 2022/3/13 33 通過高壓泵，連續(xù)的將流動相按一定流速流過柱子，通過進(jìn)樣器注入樣品混合物。因而其遷移率僅反映蛋白質(zhì)分子大小，故廣泛用于 蛋白質(zhì)分子量的測定 。 2022/3/13 42 等 電 聚 焦 電 泳 IEFE Isoelectric Focusing Electrophoresis ? IEFE一種利用具有 pH梯度的支持介質(zhì)分離等電點不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。 其次一些低 pI的載體兩性電解質(zhì)分子 （ 荷其次多的負(fù)電 ） 也將向陽極移動 ， 直到它的凈電荷被減少到零才停止 。 2022/3/13 54 —— 利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上而使酶固定化的方法 （二）固定化方法 吸附法 包埋法 結(jié)合法 交聯(lián)法 分類 2022/3/13 55 常用吸附劑 —— 活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石。 載體 —— 不溶于水的離子交換劑 :離子交換樹脂 ? 特點 —— 操作簡單、條件溫和、不會使酶失活；結(jié)合力弱、易脫落。 雙功能試劑： O O 常用的是戊二醛 H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H （ a）酶分子之間用雙功能基團(tuán)的化學(xué)交聯(lián)試劑相互交聯(lián)成水不溶性的固定化酶 2022/3/13 66 在沒有其它載體參與 ， 僅通過酶分子間交聯(lián)形成的固定化酶 ， 顆粒很小 ， 而且機(jī)械性能不佳 ，為克服這一缺點 ， 一般可先將酶吸附于載體上 ，或者包埋于膠內(nèi)或微囊內(nèi) ， 然后再交聯(lián)制成固定化酶 “ 網(wǎng) ” 膜或 “ 網(wǎng) ” 顆粒 。 2022/3/13 71 (4) 保藏穩(wěn)定性： 固相酶比天然酶保存的時間更長 。 (1) 載體性質(zhì)對最適 pH影響： 用帶負(fù)電荷載體制備的固定化酶 ， 最適 pH比游離酶最適 pH高 。 如： 胰蛋白酶既可作用于高分子的蛋白質(zhì) ， 又可作用于低分子的二肽或多肽 ， 固定在羧甲基纖維素上的胰蛋白酶 ， 對二肽或多肽的作用保持不變 ， 而對酪蛋白的作用僅為游離酶的 3％ 左右 . 以羧甲基纖維素為載體經(jīng)迭氮法制備的核糖核酸酶 ，當(dāng)以核糖核酸為底物時 ， 催化速度僅為游離酶的 2%左右 ，而以環(huán)化鳥苷酸為底物時 ， 催化速度可達(dá)游離酶的 50～60％ 。 1973年已用于工業(yè)化生產(chǎn) ， 用于制造各種半合成青霉素和頭孢霉素 。 2022/3/13 82 ② 環(huán)境監(jiān)測 Ⅰ 、早在 50年代末， Weiss等就用魚腦乙酚膽堿酶活力受抑制程度來監(jiān)測水中極低濃度的有機(jī)磷農(nóng)藥。 Ⅲ 、利用固定化酶可以檢測有機(jī)磷、有機(jī)氯農(nóng)藥和其他痕劑量的環(huán)境污染物，具有靈敏度高、性能穩(wěn)定，可以連續(xù)測定等優(yōu)點。 2022/3/13 80 ① 水凈化 ： 20世紀(jì) 70～ 80年代，固定化酶已被用于水和空氣的凈化。 從曲霉中提取的淀粉酶可用于治療消化不良、溶菌酶可用于抗菌、消炎。 用不帶電荷載體制備的固定化酶 ， 最適 pH一般不改變 。 偶聯(lián)于瓊脂糖后 ，在同樣條件下 ， 卻可保存 82%的活力 ， 因此固相酶有利于運(yùn)輸 、 貯存和重復(fù)使用 。 2022/3/13 67 (三 )固定化酶的性質(zhì)
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