【正文】 酶分子經(jīng)固相化后 ， 從游離態(tài)變?yōu)榻Y(jié)合態(tài) 。 2022/3/13 63 2） 共價(jià)鍵結(jié)合 —— 選擇適宜的載體，使之通過共價(jià)鍵與酶結(jié)合在一起的固定化方法。 固定化對于吸附載體的要求包括： 無生物毒抗物理降解、具有抗化學(xué)降解、抗生物降解的穩(wěn)定性，具有一定的機(jī)械強(qiáng)度和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。 蛋白質(zhì)在此 pH梯度凝膠中泳動(dòng)，當(dāng)遷移至 pH值等于 pI處時(shí)，就不再泳動(dòng)，而被濃縮成狹窄的區(qū)帶。 ? 等電聚焦 就是在電泳介質(zhì)中放入 載體兩性電解質(zhì) ，當(dāng)通以直流電時(shí)，兩性電解質(zhì)即形成一個(gè)由 陽極到陰極逐步增加的 pH梯度 ，在此體系中，不同的蛋白質(zhì)即移動(dòng)到或聚焦于其相當(dāng)?shù)牡入婞c(diǎn)位置上，也就是說被聚焦于一個(gè)狹的區(qū)帶中，電泳技術(shù)中的等電點(diǎn)聚焦也稱為聚焦電泳。具有分子篩的作用。 2022/3/13 34 （ 3）酶分離純化的電泳技術(shù) 電泳 — 在外電場作用下，由于蛋白質(zhì)所帶凈電荷的大小和性質(zhì)不同，因而其泳動(dòng)方向和速率也不同，從而達(dá)到分離的目的。 2022/3/13 28 原理： 利用生物大分子間 特異的親和能力 來純化生物大分子，如： 抗原和抗體；酶和底物或輔酶或抑制劑；激素和受體； RNA和其互補(bǔ)的 DNA等。通過控制 T，使大量雜質(zhì)蛋白變性除去。 ? 室溫下，這些有機(jī)溶劑不僅能使蛋白質(zhì)沉淀，而且伴隨著變性。 ? 鹽析沉淀一般不引起蛋白質(zhì)變性。 2022/3/13 3 酶工程的內(nèi)容 （ 1）對天然酶的開發(fā)和生產(chǎn)（包括微生物酶的發(fā)酵和提取以及從動(dòng)植物中提取酶的技術(shù)）、包括酶的分離純化及鑒定技術(shù)； （ 2）酶分子的修飾技術(shù)，人工設(shè)計(jì)及與其他生物技術(shù)領(lǐng)域的交叉和滲透。 應(yīng)用 2022/3/13 6 一、酶制劑的生產(chǎn) 2022/3/13 7 （ 一 ） 酶的提取與分離純化 目的：把酶從生物體中提取出來 ， 使之與雜質(zhì)分開而達(dá)到與使用目的相適應(yīng)的純度；防酶變性失活 。 2022/3/13 17 ? 不同的蛋白質(zhì)分子，由于其分子表面的極性基團(tuán)的種類、數(shù)目以及排布的不同，其水化層厚度不同，故鹽析所需要的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)中鹽的濃度，可以使不同的蛋白質(zhì)分別沉淀。 2022/3/13 20 4）等電點(diǎn)沉淀法 —— 溶解度的差異 ? 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，其溶解度與其凈電荷數(shù)量有關(guān)，隨溶液 pH變化而變化。 1）凝膠過濾層析： 分 離酶蛋白時(shí)， 分子大小 大于凝膠孔徑的蛋白被凝膠排阻，因而在凝膠顆粒間隙中移動(dòng)，速度較快；小分子蛋白質(zhì)則可自由出入凝膠顆粒的小孔內(nèi)，路徑加長，移動(dòng)緩慢。 3） 親和層析法 2022/3/13 29 利用對配體的特異生物學(xué)親和力的純化方法 親和色譜顆粒 具有極強(qiáng)的專一性 2022/3/13 31 親和層析的四個(gè)要素 Affinity 2022/3/13 32 4） 高效液相色譜層析（ HPLC） ? 特點(diǎn)： ①使用的固相支持劑顆粒很細(xì)，表面積很大 ,因而分辨率很高。區(qū)帶的位置可用專一蛋白質(zhì)染料染色顯示，有些也可利用伴有顏色變化的酶催化反應(yīng)來顯示。 2022/3/13 41 ? 濃度梯度凝膠電泳 從凝膠頂部到底部丙烯酰胺的濃度呈梯度變化，如通常頂部凝膠濃度為 5％，底部凝膠濃度為 25％。 pH范圍： pH3~10 丙烯酸 +多乙烯多胺 →→→ Ampholine（ LKB） 加成反應(yīng) 2022/3/13 45 ㈠ 沒通電時(shí)的變化 所有的載體兩性電解質(zhì)分子都荷電 ， 只是溶液中荷正電和荷負(fù)電的基團(tuán)數(shù)目相等 ， 凈電荷為零 。是 將完整細(xì)胞固定 在載體上的技術(shù) : ? (1)它免去了破碎細(xì)胞提取酶等步驟，直接利用細(xì)胞內(nèi)的酶， ? (2)固定后酶活基本沒有損失。 1）凝膠包埋法 —— 將酶或含酶菌體包埋在各種凝膠內(nèi)部的微孔中，制成一定形狀的固定化酶，大多數(shù)為球狀或片狀。 物理交聯(lián)法： 利用細(xì)胞自絮凝形成顆粒（顆粒污泥）作為固定化的方法，此法在高濃度有機(jī)廢水的處理方面正在發(fā)揮越來越大的作用。 2022/3/13 68 1. 穩(wěn)定性： 固相酶的穩(wěn)定性比游離酶高 ， （ 1） 熱穩(wěn)定性： 固定化酶熱穩(wěn)定性較之天然酶提高 。 2022/3/13 73 (2) 同種酶 ， 采用不同的方法或不同載體固定化后 ， 其最適溫度可能不同 。 若酶催化反應(yīng)產(chǎn)物為中性時(shí) ， 固定化酶最適 pH不變 。 此固定化酶在國內(nèi)外均進(jìn)行過廣泛的研究和應(yīng)用， 1973年就已用于工業(yè)化生產(chǎn)。 2022/3/13 81 b. 食品工業(yè)廢水 將固定化蛋白酶應(yīng)用于糧食加工廢水的預(yù)處理，其后續(xù)工藝可以采用任何一種生物處理法。 2022/3/13 84 復(fù)習(xí)題 ? 酶分離純化方法的基本原理 ? 酶的固定化方法 ? 舉例說明固定化酶在環(huán)境污染治理中的應(yīng)用