細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)(完整版)
【正文】 tion ? 用途：分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器 。 （一）差速離心 Differential centrifugation ? 特點(diǎn)： – 介質(zhì)密度均一； – 速度由低向高 ， 逐級(jí)離心 。 六、 PCR 技術(shù) ? PCR即： polymerase chain reaction。 – 14C半衰期為 5730年 ， 3H為 。 二、免疫細(xì)胞化學(xué) immunocytochemistry ? 根據(jù)免疫學(xué)原理 ， 利用抗體同特定抗原專(zhuān)一結(jié)合 ， 對(duì)抗原進(jìn)行定位測(cè)定的技術(shù) 。 顯示多糖常用乙醇固定 ， 顯示酶類(lèi)多用甲醛丙酮緩沖液固定 。 （二）掃描電子顯微鏡 Scanning electron microscope（ SEM） ? 工作原理：是用一束極細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級(jí)電子，次級(jí)電子的多少與樣品表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，次級(jí)電子由探測(cè)器收集，信號(hào)經(jīng)放大用來(lái)調(diào)制熒光屏上電子束的強(qiáng)度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。 ? 通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，丙酮逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進(jìn)的方式切片，重金屬（鈾、鉛）鹽染色。 （八）當(dāng)代顯微鏡的發(fā)展趨勢(shì) ? 采用組合方式 ， 集普通光鏡加相差 、熒光 、 暗視野 、DIC、 攝影裝置于一體 。 但是染色會(huì)引起樣品變形 ， 也可使有生命的機(jī)體死亡 。 （三）激光共聚焦掃描顯微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM ? 用激光作光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描。第二章 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù) METHODS AND TECHNIQUES 本章內(nèi)容提要 ? 第一節(jié) 顯微技術(shù) ? 一、光學(xué)顯微鏡 ? 二、電子顯微鏡 ? 三、顯微操作技術(shù) ? 第二節(jié) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù) ? 第三節(jié) 細(xì)胞分離技術(shù) ? 第四節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞雜交 第一節(jié) 顯微技術(shù) ? 光學(xué)顯微鏡：以可見(jiàn)光（或紫外線）為光源。 ? 能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。 要觀察不染色的新鮮組織 、細(xì)胞或其他微小活體必須使用位相顯微鏡 。 ? 自動(dòng)化與電子化 。 2）冰凍蝕刻 freezeetching ? 亦稱(chēng)冰凍斷裂 。 ? 為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級(jí)電子，標(biāo)本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級(jí)電子信號(hào)。 （二）顯示方法 1. 金屬沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后 ， 反應(yīng)產(chǎn)物最終生成 CoS或 PbS有色沉淀 ， 而顯示出酶活性 。 常用的標(biāo)記物有熒光素和酶 。 四、分子雜交技術(shù) ? 具有互補(bǔ)核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段 ， 在適當(dāng)條件下 ， 通過(guò)氫鍵結(jié)合 ， 形成 DNADNA， DNARNA或RNARNA雜交的雙鏈分子 。 ? 反應(yīng)體系：①樣品 DNA；②引物（ primer），約 1520個(gè)核苷酸；③ 4種 dNTP；④ Tag DNA聚合酶，來(lái)自于嗜熱水生菌 Thermus aquaticus，最適作用溫度 75~80℃ ，短時(shí)間在 95℃ 下不失活。 ? 用途：分離大小相差懸殊的細(xì)胞和細(xì)胞器 。 ? 特點(diǎn)：介質(zhì)密度較低 ， 介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度 。 包被細(xì)胞的液流稱(chēng)為鞘液 ， 所用儀器稱(chēng)為流式細(xì)胞計(jì) （ flow cytometer） 。 ? 異核體： 不同基因型的細(xì)胞融合而成 。 ? 誘發(fā)融合：
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