【正文】 細(xì)胞，除頂端較幼細(xì)胞的原生質(zhì)比較稠密均勻 外，大多數(shù)細(xì)胞都出現(xiàn)大的空泡。 ②迅速生長(zhǎng)期 此時(shí)菌絲體干重迅速增加，其立方根與時(shí)間成直線關(guān)系。 分批發(fā)酵的特點(diǎn) 微生物所處的環(huán)境在發(fā)酵過(guò)程中不斷變化，其物理，化學(xué)和生物參數(shù)都隨時(shí)間而變化，是一個(gè)不穩(wěn)定的過(guò)程。 第一節(jié) 發(fā)酵過(guò)程的代謝變化規(guī)律 代謝變化就是反映發(fā)酵過(guò)程中菌體的生長(zhǎng)，發(fā)酵參數(shù)（培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件等）和產(chǎn)物形成速率三者間的關(guān)系。從而限制退化菌株在數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)，最后淘汰已退化菌落而使原菌株得得以復(fù)壯。 （ 3）利用不同類型的細(xì)胞進(jìn)行傳 代 在放線菌和霉菌中，由于它們的菌絲細(xì)胞常含有許多核，甚至是異核體，因此用菌絲接種時(shí)就會(huì)出現(xiàn)衰退和不純的子代。 其它因素 其它如溫度、濕度、培養(yǎng)基成分及各種培養(yǎng)條件都會(huì)引起菌種的基因突變。為了得到較多純種，有人考慮提高誘變劑量，使單核細(xì)胞 DNA 雙鏈中一條鏈的某一點(diǎn)發(fā)生突變 ，另一條鏈完全失活不再?gòu)?fù)制來(lái)提高純菌產(chǎn)生率。很多抗生素生物合成、產(chǎn)生氣生菌絲和色素等性狀都部分或全部受質(zhì)?；蚩刂?。因此，必須正確判斷是否退化，才能找出正確的解決辦法。常見(jiàn)的菌種衰退在形態(tài)上表現(xiàn)為分生孢子的減少或菌落顏色的改變。 微生物在此條件下易死亡，所以需加入一些物質(zhì)作保護(hù)劑，一般常用的是脫脂牛奶、血清等。 這種方法也比較簡(jiǎn)便，且保藏時(shí)間一般可長(zhǎng)達(dá) l年以上。其任務(wù)首先是使菌種不致死亡，同時(shí)還要盡可能設(shè)法把菌種的優(yōu)良特性保持下來(lái)而不致向壞的方面轉(zhuǎn)化。 (3)一級(jí)種子質(zhì)量要求 種齡： 12h， pH 值： 177。 3，產(chǎn)物生成量 在抗生素發(fā)酵中，產(chǎn)物生成量是考察種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，因?yàn)榉N子液中產(chǎn)物生成量的多少間接反映種子的生產(chǎn)能力和成熟程度。 接種量的大小決定于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中生長(zhǎng)繁殖的速度，采用較大的接種量可以縮短發(fā)酵罐中菌絲繁殖達(dá)到高峰的時(shí)間，使產(chǎn)物的形成提前到來(lái)，并可減少雜菌的生長(zhǎng)機(jī)會(huì)。例如，青霉素的生產(chǎn)菌種在制備過(guò)程中將通氣充足和不足兩種情況下得到的種子分別接入發(fā)酵罐內(nèi)，它們的發(fā)酵單位可相差 1 倍。如土霉素生產(chǎn)菌種孢子斜面培養(yǎng) 4 天左右即于 4℃冰箱保存，發(fā)現(xiàn)冷藏 7~8天菌體細(xì)胞開(kāi)始自溶。 （ 2）濕度 制備斜面孢子培養(yǎng)基的濕度對(duì)孢子的數(shù)量和質(zhì)量有較大的影響。原材料質(zhì)量的波動(dòng)，起它要作用的是其中 無(wú)機(jī)離子含量不同，如微量元素 Mg2+ 、 Cu2+ 、 Ba2+能刺激孢子的形成。 比如： 細(xì)菌：生長(zhǎng)快，種子用量比例少，級(jí)數(shù)也較少，二級(jí)發(fā)酵。將孢子接入含液體培養(yǎng)基的搖瓶中，于搖瓶機(jī)上恒溫振蕩培養(yǎng)，獲得菌絲體，作為種子。 細(xì)菌菌體培養(yǎng)時(shí)間一般為 1~2 天，產(chǎn)芽孢的細(xì)菌培養(yǎng)則需要 5~10 天。種子液質(zhì)量的優(yōu)劣對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)起著關(guān)鍵性的作用。第七章 生產(chǎn)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)與保藏 目前工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵罐容積已達(dá)到幾十立方米或幾百立方米。 種子擴(kuò)大培養(yǎng)：是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，在經(jīng)過(guò)扁瓶或搖瓶及種子罐逐級(jí)放大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過(guò)程。 2，霉菌孢子的制備 霉菌孢子的培養(yǎng)一般以大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基。其過(guò)程如下： 試管→三角瓶→搖床→種子罐 2，厭氧培養(yǎng) 對(duì)于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等），其種子的制備過(guò)程如下： 試管→三角瓶→卡式罐→種子罐 例如生產(chǎn)啤酒的酵母菌一般保存在麥芽汁瓊脂或 MYPG培養(yǎng)基（培養(yǎng)基配制： 3 克麥芽浸出物，3 克酵母浸出物， 5 克蛋白胨， 10 克葡萄糖和 20 克瓊脂與升水中）的斜面上，于 4℃冰箱內(nèi)保藏。 茄子瓶→種 子罐→發(fā)酵罐 霉菌：生長(zhǎng)較慢，如青霉菌，三級(jí)發(fā)酵 孢子懸浮液→一級(jí)種子罐（ 27℃ ,40 小時(shí)孢子發(fā)芽，產(chǎn)生菌絲 ）→二級(jí)種子罐（ 27℃， 10~24小時(shí)，菌體迅速繁殖，粗壯菌絲體）→發(fā)酵罐 放線菌：生長(zhǎng)更慢，采用四級(jí)發(fā)酵 酵母：比細(xì)菌慢，比霉菌，放線菌快，通常用一級(jí)種子 3，確定種子罐級(jí)數(shù)需注意的問(wèn)題 （ 1）種子級(jí)數(shù)越少越好，可簡(jiǎn)化工藝和控制，減少染菌機(jī)會(huì) （ 2）種子級(jí)數(shù)太少，接種量小，發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率，增加染菌機(jī)會(huì) （ 3）雖然種子罐級(jí)數(shù)隨產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模而定。磷含量太多或太少也會(huì)影響孢子的質(zhì)量。例如土霉素生產(chǎn)菌種龜裂鏈霉菌，孢子制備時(shí)發(fā)現(xiàn)：在北方氣候干燥地區(qū)孢子斜面長(zhǎng)得較快，在含有少量水分的試管斜面培養(yǎng)基下部孢子長(zhǎng)得較好，而斜面上部由于水分迅速蒸發(fā)呈干疤狀，孢子稀少。而培養(yǎng) 5 天以后冷藏， 20 天未發(fā)現(xiàn)自溶。但也有例外，例如土霉素生產(chǎn)菌，一級(jí)種子罐的通氣量小對(duì)發(fā)酵有利。但接種量過(guò)大或者過(guò)小，均會(huì)影響發(fā)酵。 4，酶活力 種子液中某種酶的活力，與目的產(chǎn)物的產(chǎn)量有一定的關(guān)聯(lián)。 光密度：凈增 OD 值 以上 殘?zhí)牵?％以下 無(wú)菌檢查： () 噬菌體檢查： () 鏡檢：菌體生長(zhǎng)均勻、粗壯，排列 整齊 革蘭氏陽(yáng)性反應(yīng)。 菌種保藏的原理 菌種保藏主要是根據(jù)菌種的生理生化特點(diǎn)人工創(chuàng)造條件使孢子或菌體的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)盡量降低，以減少其變異。適于保存部分霉菌、酵母菌、放線菌，但對(duì)細(xì)菌效果較差，對(duì)某些能同化烴類的微生物則不適用。該法存活率高，變異率低，并能廣泛適用于細(xì)菌 （ 有芽孢和無(wú)芽孢的 ） 、酵母、霉菌孢子、放線菌孢子和病毒等，因此是目前廣泛采用的好方法。在生理上常指菌種發(fā)酵能力的降低，有些菌的抗噬菌體能力下降。一般菌種退化是從量變到質(zhì)變逐漸發(fā)生的，同時(shí)也是整個(gè)群體中產(chǎn)量降低及其相聯(lián)系的種種特性的變化，而不是指單個(gè)細(xì)胞的改變。當(dāng)菌株連續(xù)傳代、菌體發(fā)生質(zhì)粒脫落而出現(xiàn)大量光禿型菌落，則生產(chǎn)能力也顯著下降。通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到下表所示數(shù)據(jù)。例在保藏菌種中基因突變率就隨溫度降低而減少，又例在產(chǎn)腺苷的黃膘吟缺陷型 中，若在培養(yǎng)基中加入黃嘌呤、鳥嘌呤及組氨酸和蘇氨酸可降低回復(fù)突變的數(shù)量。而孢子一般是單核的，利用孢子來(lái)接種，可以達(dá)到防止衰退的目的。例如用高劑量 UV或再配以低劑量 NTG對(duì)退化菌株進(jìn)行處理，可得到較多的純菌落，又如選擇一種對(duì)退化型菌株細(xì)胞核具有更大殺傷力的誘變劑亦可使原菌株得到復(fù)壯。 了解生產(chǎn)菌種在具有合適的培養(yǎng)基、 pH、溫度和通氣攪拌等環(huán)境條件下對(duì)基質(zhì)的利用、細(xì)胞的生長(zhǎng)以及產(chǎn)物合成的代謝變化，有利于人們對(duì)生產(chǎn)的控制。 分批發(fā)酵的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)： 操作簡(jiǎn)單； 操作引起染菌的概率低。因?yàn)檎婢皇菃渭?xì)胞，其繁殖不以幾何倍數(shù)增加，故而沒(méi)有對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。 生長(zhǎng)的停止由以下兩種因素之一所決定。 其動(dòng)力學(xué)方程為： ②第二類型（部分生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型） 產(chǎn)物也來(lái)源于能量代謝所消耗的基質(zhì)，但產(chǎn)物的形成在與初級(jí)代謝分開(kāi)的次級(jí)代謝中，出現(xiàn)兩個(gè)峰，菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，出現(xiàn)產(chǎn)物形成高峰（見(jiàn)下圖）。 殺念珠菌素發(fā)酵中葡萄糖、 DNA、抗生素產(chǎn)量的代謝變化 A： DNA； B：葡萄糖； C：殺念珠菌素產(chǎn)量 6，分批發(fā)酵的分類對(duì)實(shí)踐的指導(dǎo)意義 從上述分批發(fā)酵類型可以分析：如果生產(chǎn)的產(chǎn)品是生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型（如菌體與初級(jí)代謝產(chǎn)物），則宜采用有利于細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件，延長(zhǎng)與產(chǎn)物合成有關(guān)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；如果產(chǎn)品是非生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型（如次級(jí)代謝產(chǎn)物），則宜縮短對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并迅速獲得足夠量的菌體細(xì)胞后延長(zhǎng)平衡期，以提高產(chǎn)量。 一、溫度對(duì)發(fā)酵的影響及控制 1，影響發(fā)酵溫度的因素 （ 1）產(chǎn)熱因素：生物熱和攪拌熱。發(fā)酵旺盛期的生物熱大于其他時(shí)間的生物熱。 攪拌熱的計(jì)算： Q 攪拌 =3600（ P/V） 式中 3600：熱功當(dāng)量（ kJ/（ ）） 抗生素相對(duì)活性為 1 抗生素相對(duì)活性為 （ P/V）：通氣條件下單位體積發(fā)酵液所消耗的功率（ kW/m3） （ 3）蒸發(fā)熱 定義：通入發(fā)酵罐的空氣，其溫度和濕度隨季節(jié)及控制條件的不同而有所變化。在低于 30℃溫度下，該菌種合成金霉素能力較強(qiáng)。 最適發(fā)酵溫度的選擇：在發(fā)酵的整個(gè)周期內(nèi)僅選一個(gè)最適培養(yǎng)溫度不一定好。一般根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定。許多研究工作者已經(jīng)考慮到氧、碳源、氮源轉(zhuǎn)化為生物物質(zhì)的總化學(xué)計(jì)量關(guān)系，并利用這樣的關(guān)系來(lái)預(yù)測(cè)發(fā)酵的需氧情況。例如 Cooney(1979)建議用下列方程式計(jì)算青霉素發(fā)酵： 但是，由于菌體的代謝是受發(fā)酵液中的溶氧濃度的影響，故簡(jiǎn)單地依據(jù)總需求來(lái)供氧是欠妥的。研究表明：菌體的臨界溶氧濃度為 ；并根據(jù) ―安全 ‖的程度予以考慮供氧的程度，也即把菌體的呼吸率作為最大呼吸率的一個(gè)組成部分。 發(fā)酵過(guò)程的溶氧變化 發(fā)酵前期：由于微生物大量繁殖，需氧量不斷大幅度增加，此時(shí)需氧超過(guò)供氧，溶氧明顯下降。例如，發(fā)酵液中 CO2的濃度達(dá)到 101mol，就會(huì)嚴(yán)重抑制酵母的生長(zhǎng)；當(dāng)進(jìn)氣口 CO2的含量占混合氣體的 80%時(shí)，酵母活力與對(duì)照相比降低 20%。在發(fā)酵過(guò)程中通常通過(guò)調(diào)節(jié)通風(fēng)和攪拌來(lái)控制。泡沫與液體間沒(méi)有明顯的波面界限，在鼓泡的發(fā)酵液中氣體分散相占的比例由下而上地逐漸增加。在發(fā)酵后期菌體自溶，可溶性蛋白質(zhì)濃度增加，又促使泡沫上升。 ?不影響以后的提取過(guò)程。聚二酵具有消沫效果持久的特點(diǎn)，尤其適用于霉菌發(fā)酵。 六、補(bǔ)料控制 1，基質(zhì)濃度對(duì)發(fā)酵的影響 2，補(bǔ)料控制目的 在發(fā)酵過(guò)程中采用不料控制的工藝主要是為解決以下問(wèn)題： （ 1）解除基質(zhì)過(guò)濃的抑制； （ 2）解除產(chǎn)物的反饋抑制； （ 3）解除葡萄糖分解代謝阻遏效應(yīng)。 例如，在谷氨酸發(fā)酵過(guò)程中的某階段，生產(chǎn)菌的攝氧率和基質(zhì)消耗速率之間存在著線性關(guān)系。 連續(xù)補(bǔ)料和分批補(bǔ)料發(fā)酵的比較 補(bǔ) 料速率的確定 優(yōu)化補(bǔ)料速率也是補(bǔ)料控制中十分重要的一環(huán)，因?yàn)轲B(yǎng)分和前體需要維持適當(dāng)?shù)臐舛?，而它們則以不同的速率被消耗，所以補(bǔ)料速率要根據(jù)微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)等的消耗速率及所設(shè)定的培養(yǎng)液中最低維持濃度而定。除原料蒸煮過(guò)程能起到滅菌作用外，空氣、水、工具和場(chǎng)所，窖池等都存在大量的多種多樣的微生物，并把這些微生物帶到發(fā)酵原料中，它們與曲中的微生物一起協(xié)同作用，生產(chǎn)出豐富的香味物質(zhì)，因此固體厭氣發(fā)酵是多菌種的混合發(fā)酵。 固體發(fā)酵的 pH 控制 一般工廠用酸度表示。 液態(tài)發(fā)酵 厭氣發(fā)酵在液體狀態(tài)下進(jìn)行，液體發(fā)酵速度快，發(fā)酵完全，發(fā)酵周期短，原料利用率高，而且適于大規(guī)模機(jī)械化、連續(xù)化、自動(dòng)化生產(chǎn)。 3，攪拌轉(zhuǎn)速 是指 攪拌器在發(fā)酵罐中轉(zhuǎn)動(dòng)速度。粘度的大小可改變氧傳遞的阻力。利用 DO 濃度的變化，可以了解微生物對(duì)氧利用的規(guī)律，反映發(fā)酵的異常情況，是一個(gè)重要的控制參數(shù)。分別表示菌體生長(zhǎng)情況，能量代謝能力，生物合成能力。 四、間接參數(shù) 根據(jù)發(fā)酵液的菌體量和單位 時(shí)間的菌濃、溶氧濃度、基質(zhì)濃度和產(chǎn)物濃度等參數(shù)的變化值，可分別計(jì)算出菌體的比生長(zhǎng)速率、氧的比消耗速率、基質(zhì)的比消耗速率和產(chǎn)物比生產(chǎn)速率。 5，產(chǎn)物濃度 是發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量高低，代謝正常與否的重要參數(shù)，也是決定發(fā)酵周期長(zhǎng)短的根據(jù)。 7，濁度 能及時(shí)反映單細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。 發(fā)酵罐的容積 (L) 攪拌轉(zhuǎn)速范圍 (r/min) 3 10 30 50 200~2020 200~1200 150~1000 100~800 200 500 10000 50000 50~400 50~300 25~200 25~160 4，攪拌功率 指攪拌器攪拌時(shí)所消耗的功率，常指每立方米發(fā)酵液所消耗的功率（ kW/m3）。 在發(fā)酵過(guò)程中對(duì) pH、溫度進(jìn)行連續(xù)控制，中間分析也與通風(fēng)發(fā)酵相似。在發(fā)酵過(guò)程中酸度增加的原因，主要是雜菌的影響，淀粉濃度過(guò)高，糖化快，細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖快，造成酒醅酸度升高，也反過(guò)來(lái)影響酵母的生長(zhǎng)，影響發(fā)酵，酸度低又影響糖化速度。當(dāng)采用 20~30℃低溫時(shí)，糖化酶作用緩慢，故糖化時(shí)間要延長(zhǎng)。 七、厭氧發(fā)酵工藝要求與控制 發(fā)酵工業(yè)中，由于使用微生物不同，其代謝規(guī)律不一樣，因而有的是需氧發(fā)酵，有的是厭氧發(fā)酵，也稱靜置培養(yǎng)?？蓪⒀a(bǔ)科速率控制在與基質(zhì)消耗速 率相等的狀態(tài)。 補(bǔ)料的原則 在補(bǔ)料過(guò)程要遵循以下原則 （ 1）控制微生物的中間代謝，使之向著有利于產(chǎn)物積累的方向發(fā)展。 選擇消泡劑的依據(jù) ?對(duì)發(fā)酵過(guò)程無(wú)毒，對(duì)人、畜無(wú)害和不影響酶的生物合成。 ?不干擾分析系統(tǒng)，如溶解氧、 pH 測(cè)定儀的探頭。 方法：罐內(nèi)消沫法；罐外消沫法。 4，泡沫對(duì)發(fā)酵的不利影響 發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生的泡沫對(duì)發(fā)酵過(guò)程具有以下不利影響： （ 1）降低發(fā)酵設(shè)備的利用率； （ 2）增加了菌群的非均一性； （ 3）增加了染菌的機(jī)會(huì)； （ 4）導(dǎo)致產(chǎn)物的損失； （ 5）消泡劑會(huì)給后提取工序帶來(lái)困難。泡沫間被一層液膜隔開(kāi)而彼此不相連通。如牛鏈球菌發(fā)酵生產(chǎn)多糖，最重要的發(fā)酵條件是提供的空氣中要含 5%的 CO2。 發(fā)酵后期由于菌體衰老，呼吸減弱，溶氧濃度也會(huì)逐步上升，一旦菌體自溶，溶氧就會(huì)明顯地上升。 當(dāng)溶氧濃度低于 時(shí)，谷氨酸和天冬氨酸族氨基酸合成受到影響，但苯丙氨酸，纈氨酸和亮氨酸最佳合成的溶氧濃度分別為 、