8第八章原位雜交組織化學(xué)-文庫(kù)吧在線文庫(kù)
【正文】 ℃ 左右）導(dǎo)致雜交液的蒸發(fā) 。 探針短 易進(jìn)入細(xì)胞，雜交率高，雜交時(shí)間短。 硫酸葡聚糖： 在核酸雜交液中硫酸葡聚糖占 10%左右；是一種大分子的多聚胺化合物，具有極強(qiáng)的水合作用，因而能大大增加雜交液的粘稠度；促進(jìn)雜交率，特別是對(duì)雙鏈核酸探針。只有具有高同源性的核苷酸序列才能形成穩(wěn)定的結(jié)合。 放射自顯影： 圖象分析儀檢測(cè)銀粒的數(shù)量和分布的差異。 ④ 檢測(cè)系統(tǒng)的對(duì)照如乳膠或酶顯色系統(tǒng)也應(yīng)在無(wú)標(biāo)記探針的情況下進(jìn)行。 ? 光敏生物素試劑種類： 光生物素（乙酸鹽） 補(bǔ)骨脂素生物素。 ６ 3min。 14 5min。 22 甘油明膠直接封片。 ⑦ 應(yīng)用 ABC復(fù)合物與等量的 1%牛血清白蛋白 PBS液混合，室 溫孵育 1h。 DigAKP檢測(cè)系統(tǒng)： 以 BCIP/NBT為底物，結(jié)果為藍(lán)紫色沉淀。經(jīng)過(guò)上述處理的切片在 20℃ 可保存２～３周，在 70℃ 可保存數(shù)月之久，也有報(bào)告可保存數(shù)年之久的，但仍以新鮮制片為好。 ③ 蛋白激酶 K消化：將組織切片放在 LEDTA中孵育 1520min。覆以硅化蓋玻片或塑料蠟?zāi)?，置于盛有少? SSC濕盒內(nèi)在 42℃ ， 16～ 18h過(guò)夜。反應(yīng)顏色為藍(lán)紫色。 :05:5911:05Mar2312Mar23 1故人江海別，幾度隔山川。 11:05:5911:05:5911:053/12/2023 11:05:59 AM 1成功就是日復(fù)一日那一點(diǎn)點(diǎn)小小努力的積累。 , March 12, 2023 閱讀一切好書(shū)如同和過(guò)去最杰出的人談話。 2023年 3月 12日星期日 11時(shí) 5分 59秒 11:05:5912 March 2023 1一個(gè)人即使已登上頂峰，也仍要自強(qiáng)不息。勝人者有力，自勝者強(qiáng)。 2023年 3月 12日星期日 上午 11時(shí) 5分 59秒 11:05: 1楚塞三湘接，荊門九派通。 2023年 3月 上午 11時(shí) 5分 :05March 12, 2023 1行動(dòng)出成果，工作出財(cái)富。 ⑨ 以 PBS/甘油封固切片，如要永久保存，可用 DPX封固。 ④ 緩沖液 Ⅰ 漂洗 3 3min；浸入緩沖液 Ⅱ ，室溫 10min。 ⑥ 以 PBS漂洗 2 3min。 下列步驟所需玻璃器皿均需消毒，操作者需戴手套。 地高辛標(biāo)記探針具有非放射性探針的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)人體無(wú)害，不受 半衰期限制，探針可長(zhǎng)期保存。 地高辛標(biāo)記 cRNA探針的應(yīng)用 地高辛標(biāo)記 cRNA探針的應(yīng)用 原理： 地高辛（ Dig）為類固醇半抗原，僅存在于洋地黃類植物，其抗體與其它任何固醇類似物無(wú)交叉反應(yīng)，地高辛標(biāo)記于脫氧尿嘧啶三磷酸核苷（ dUTP）上形成 Dig11dUTP。 ③ PBS洗 2 3min，加入抗生物素血清和正常山羊血清，室溫 1h或 4℃ 過(guò)夜。 18 緩沖液 Ⅰ 洗 2 5min。 10 蓋上硅化蓋玻片或蠟?zāi)ぃ?43℃ 濕盒保溫 12— 16h。 ２ 。 兩種方法的比較： ? （ 1）直接標(biāo)記的 DNA探針雜交后經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單洗滌就可顯示雜交信號(hào)，簡(jiǎn)單方便，而間接標(biāo)記的探針雜交后需通過(guò)繁瑣的檢測(cè)步驟； ? （ 2）間接標(biāo)記的探針可進(jìn)行多步驟信號(hào)放大，但其受配基親和力的影響。 ③ 預(yù)先將切片用 DNA酶或 RNA酶消化，然后用 ISHH技術(shù)證明丟失的是 DNA或 RNA。 ? 注意事項(xiàng)： 漂洗過(guò)程中切勿使切片干燥。 ? 低嚴(yán)格度： 雜交及沖洗條件在 Tm35– 40℃ 之間，高鹽或低甲酰胺濃度。原位雜交中， DNA、 RNA探針需要的 Tm分別是 90℃ 、 95℃ ，這種高溫對(duì)保存組織形態(tài)完整和保持組織切片粘附在載玻片上是不可能的。最佳原 則應(yīng)是應(yīng)用最低探針濃度以達(dá)到與靶核苷酸的最大飽和結(jié)合 度為目的。 ⑤ 雜交前及雜交時(shí)所用的溶液需經(jīng)高壓消毒處理。 （ 3）減低背景染色 ? 預(yù)雜交（ Prehybridization） : 是減低背景染色的一種有效手段。 組織也可在取材后直接置入液氮冷凍，切片后才將其浸入 4%多聚甲醛約 10min，空氣干燥后保存在 70℃ 。 ④ 新的非放射性標(biāo)記技術(shù)正在繼續(xù)不斷涌現(xiàn)。 分類： 根據(jù)所用探針和靶核苷酸不同 DNADNA雜交、 DNARNA雜交、 RNARNA雜交 根據(jù)探針標(biāo)記物是否直接被檢測(cè) — 直接法、間接法 一 原位雜交的由來(lái)與發(fā)展 （一）核酸分子雜交技術(shù) ? 按其作用方式大致分為液相雜交和固相雜交兩種 ? 液相雜交： 參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中。 戊二醛： 能較好地保存 RNA和組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，但由于和蛋白質(zhì) 產(chǎn)生廣泛的交叉連接，從而影響了
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