細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)入門(mén)-文庫(kù)吧在線(xiàn)文庫(kù)
【正文】 以要放入烤箱內(nèi)烘干備用。 3. 膠帽，離心管帽烘干后只能在 2％氫氧化鈉溶液中浸泡 612 小時(shí)（切記時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)），自來(lái)水洗凈，烘干。為了防止清洗器材已消毒與末消毒發(fā) 生混淆，可在紙包裝后，用密寫(xiě)墨水作好標(biāo)記。 器皿時(shí)防止酸液濺到地面，會(huì)腐蝕地面。 三 . 胰蛋白酶溶液的配制與消毒： 胰蛋白酶的作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。 ：配好的胰酶溶液要在超凈臺(tái)內(nèi)用注射濾器（ 微米微孔濾膜）抽濾除菌。然后用一個(gè)當(dāng)量的鹽酸和 NaOH 調(diào) PH到 左右。 六．血清的滅火： 細(xì)胞培養(yǎng)常用的是小牛血清，新買(mǎi)來(lái)的血清要在 56℃ 水浴中滅火 30 分鐘后，再經(jīng)過(guò)抽濾方可加入培養(yǎng)基中使用。如：稱(chēng)取 克 HEPES 溶于 20ml 三蒸水中，過(guò)濾除菌后可完全（ 20ml）加入 1L 培養(yǎng)液中，或者每 100ml 培養(yǎng)液中加入 2ml 即可。 九 .肝素溶液的配制： 含有肝素的培養(yǎng)液可以使內(nèi)皮細(xì)胞純度提高，肝素加入全培養(yǎng)液中最終濃度為 50ug/ml。首要的問(wèn)題是如何無(wú)菌準(zhǔn)確稱(chēng)量 克（配成 100ml 溶液） — 即解決無(wú)菌分裝藥品的問(wèn)題。 ：注意火焰不能太小。 三 .吹打分散細(xì)胞： ：用滴管將已經(jīng)消化細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液。 五 .繼續(xù)培養(yǎng)： 用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當(dāng)旋松瓶蓋，放入 CO2 培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。 具體操作 一 . 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備： 37℃ 75％酒精擦拭紫外線(xiàn)照射 30min 的超凈工作臺(tái)臺(tái)面。 六 .細(xì)胞計(jì)數(shù)： 細(xì)胞濃度以 5105/ml 為宜。 二 .細(xì)胞懸液制備： 細(xì)胞懸液的制備方法是用 ％的胰蛋白酶液消化、 PBS 液洗滌后，加入培養(yǎng)液（或 Hanks 液或 PBS 等平衡鹽溶液），吹打制成待測(cè)細(xì)胞懸液。 ，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其時(shí)多次取樣計(jì)數(shù)時(shí)更要注意每次取樣都要混勻，以求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確； 4. 數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞 ，若細(xì)胞聚集成團(tuán)時(shí)，只按照一個(gè)細(xì)胞計(jì)算。 細(xì)胞的凍存 4℃ 冰箱，約 40min。 0℃ ～ 60℃ 這一溫度范圍內(nèi)過(guò)久，低溫?fù)p傷主要發(fā)生在這一溫度區(qū) 內(nèi)，是 “ 危險(xiǎn)溫區(qū) ” 。 5 同時(shí)做好凍存記錄，在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄。 2. 滴入細(xì)胞懸液時(shí)蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。 ：將血球計(jì)數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀(guān)察，并移動(dòng)計(jì)數(shù)板，當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計(jì)數(shù)方格后，數(shù)出四角的四個(gè)大鉻（每個(gè)大格含有 16 個(gè)中鉻）中沒(méi)有被染液染上色的細(xì)胞數(shù)目。 ，導(dǎo)致離心機(jī)損壞和細(xì)胞丟失。 三．迅速解凍： ，并要不斷的搖動(dòng)，使管中的液體迅速融化。 附： EDTA（ ％乙二胺四乙酸二鈉）消化液配方： EDTA ， NaCl ， KCl ， KH2PO4 ， 葡萄糖 ， ％酚紅 4ml，加入蒸餾水定容至 1000ml。 四 .分裝稀釋細(xì)胞： ：將細(xì)胞懸液吸出分裝至 23 個(gè)培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋。 ：將各瓶口一一打開(kāi)，同時(shí)要在酒精燈上燒口消毒。 RPMI1640 培養(yǎng)基時(shí)因?yàn)檫€要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，為了保證培養(yǎng)液 PH 值最終為 ，可在配制時(shí)調(diào) PH 至 。注意：因?yàn)?Ⅰ 型膠原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過(guò)濾，因此可以用蔡式濾器過(guò)濾除菌。加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在 4℃ 冰箱中儲(chǔ)存 2 周以上時(shí)，應(yīng)重新加入原來(lái)的谷氨酰胺。使用終濃度為 1050mmol/L，一般培養(yǎng)液內(nèi)含 20mmol/LHEPES 即可達(dá)到緩沖能力。 ：配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過(guò)濾除菌。青霉素是 80 萬(wàn)單位 /瓶，用注射器加 4ml 滅菌雙蒸水。因 Ca2+、 Mg2+和血清、蛋白質(zhì) 克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時(shí)應(yīng)選用不含 Ca2+、 Mg2+的 BSS，如： DHanks 液。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水 二 .PBS 的制備與消毒 (也可用于其它 BSS，
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