細(xì)胞工程-動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)與原理-文庫(kù)吧在線文庫(kù)
【正文】 呈梭形或不規(guī)則三角形，中央有園形核，胞質(zhì)向外伸出 2～ 3個(gè)長(zhǎng)短不同的突起。 3）兼性貼壁細(xì)胞 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中，有些細(xì)胞呈現(xiàn)雙重性，既可以貼壁生長(zhǎng)，也可以懸浮培養(yǎng)，如中國(guó)地鼠卵巢細(xì)胞、小鼠 L929細(xì)胞等。年齡越大繼代次數(shù)越少。 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件的要求也十分復(fù)雜。 除了氧氣供應(yīng)外，還應(yīng)注意培養(yǎng)基的氧氣和 CO2的平衡。 二、取材、分離和組織消化 (to draw the materials from tissue， separation ， digestion ) （一）取材 ——獲取組織 原則上各種動(dòng)物組織都可進(jìn)行體外培養(yǎng)，而實(shí)際上幼齡組織（尤其 是胚胎組織）比老齡組織容易培養(yǎng)、分化程度低的比分化程度高的 容易培養(yǎng)、腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。 組織消化操作方法 (tissue digestion method of operation) （ 1）胰蛋白酶消化 (trypsin digestion) ① 將剪碎的組織塊放入有玻璃珠的三角燒瓶中，加入 30~50倍體積的 %胰 蛋白酶； ② 37℃ 水浴內(nèi)消化 30~60min，每 5~10min搖動(dòng)一次。 三、細(xì)胞計(jì)數(shù) (cell counting) ——計(jì)數(shù)懸浮液中細(xì)胞的形態(tài)及濃度，以判斷消化或稀釋程度（亦用于培養(yǎng)液中細(xì)胞濃度的檢查） ① 染色 ：在干凈的離心管中加入 9滴細(xì)胞懸液，再加入 1滴 %臺(tái)盼藍(lán)，混勻，靜置 2~3min； ② 充池 ：在計(jì)數(shù)板蓋片邊緣加入 1~2滴染色的細(xì)胞懸液，使之完全充滿計(jì)數(shù)板與蓋玻片間的空間（無氣泡或溢出） ③ 計(jì)數(shù)： 在顯微鏡下記錄計(jì)數(shù)板四角四個(gè)大方格中的活細(xì)胞（不染色細(xì)胞）總數(shù)。 灌注小室培養(yǎng)法 (dabble booth cultivation) 為大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)提供了參考原理。 ④ 轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶（每個(gè) 25ml的培養(yǎng)瓶可放置 20~30塊組織小塊），吸去液體。待生長(zhǎng)暈細(xì)胞擴(kuò)展至約 50%培養(yǎng)瓶底表面時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。 （三）組織塊單層細(xì)胞培養(yǎng)法 (tissue monolayer method ) 把組織剪成更小的小塊（ ~1mm3），由于其體積很小，無需任何粘著劑即能直接附于瓶壁上。為促進(jìn)細(xì)胞 貼壁，也可先在瓶?jī)?nèi)壁涂一層血清。 傳代培養(yǎng)意義：不僅在于維持細(xì)胞不斷地生長(zhǎng)，而且使培養(yǎng)物逐 步演變?yōu)榫哂性鲋衬芰Α⑻卣鲗Ｒ?、類型均勻的培養(yǎng)細(xì)胞，即 細(xì)胞 系。 太多則使細(xì)胞操作不便，以每個(gè)平皿 50~100個(gè)細(xì)胞為宜。 細(xì)胞生長(zhǎng) 潛伏期：不同組織和細(xì)胞潛伏期不同。 支持物表面帶正電荷利于貼壁。 常見病菌： 霉菌、細(xì)菌、支原體。按細(xì)胞懸液：染液 =9： 1比例混合， 4min后計(jì)數(shù)。 常用冷凍保護(hù)劑： DMSO、甘油。 ⑶藻紅 B染色： %藻紅 B（溶于 Hanks液）染色， 2h內(nèi)鏡檢。 污染后的細(xì)胞仍能生存，甚 至無明顯變化；有時(shí)可發(fā)生不同程度的病理改變。 機(jī)能不良細(xì)胞：輪廓鮮明，胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀 物；細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，失去原有特點(diǎn)；細(xì)胞間隙加大。細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓形。 培養(yǎng)方法： 向瓊脂平皿中接種稀釋細(xì)胞懸液（適應(yīng)培養(yǎng)基），培養(yǎng)后，標(biāo) 記出保留細(xì)胞，在顯微鏡下切下保留細(xì)胞處瓊脂小塊，在 BSS中輕 輕漂洗后，用適應(yīng)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。 適應(yīng)培養(yǎng)液 制備：選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，無死細(xì)胞和碎片，所用細(xì)胞的種類應(yīng)與要克隆的細(xì)胞相同。 多孔載體被證明是用于大規(guī)模高密度細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)秀細(xì)胞生長(zhǎng) 支持物，具有逐步取代傳統(tǒng)的實(shí)心微載體的趨勢(shì)。 方法： ①取一定量組織置于小燒杯中，先用 BSS漂洗 2~3次去掉血污，然后反復(fù)剪成 ~1mm3的小塊。 ③ 終止 消化：吸出消化液；加入 Hanks液，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，洗去殘留 的消化液。培養(yǎng) 3~5周，細(xì)胞不斷增長(zhǎng)，肉眼或低倍鏡下觀察可見圍繞組織周圍生長(zhǎng)猶如日暈，稱“ 生長(zhǎng)暈 ”。將組織塊切成 1mm3小塊。 細(xì)胞接種濃度： 3~10 105/ml 四、常用培養(yǎng)法 (general cultivation) （一）組織塊培養(yǎng)法 ( tissue piece cultivation) 將組織塊剪切成小塊，直接放入培養(yǎng)瓶中，貼附一段時(shí)間后，細(xì)胞從組織塊長(zhǎng)出，最終形成單層細(xì)胞。 如消化傳代細(xì)胞，可與 EDTA混用。 （二）組織消化 (tissue digestion) 用生物化學(xué)的方法將剪碎的組織塊分散成細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞。 原代（初代）培養(yǎng) ：指將機(jī)體取出的組織或細(xì)胞進(jìn)行初次培養(yǎng)的過程。液氮凍存。 永久細(xì)胞系有如下特征： 細(xì)胞形態(tài)變化，如細(xì)胞變小，黏附性減少，具有較高的核質(zhì)比； 生長(zhǎng)速率增加，倍增時(shí)間縮短；對(duì)血清的依賴性減?。? 貼壁依賴性降低；細(xì)胞異倍體和非整倍體增加，細(xì)胞接種到體內(nèi)后，生癌率上升。當(dāng)細(xì)胞在基質(zhì)上分裂增殖，逐漸匯合成片即每個(gè)細(xì)胞與其周圍的細(xì)胞相互接觸時(shí)，細(xì)胞就停止增殖，即細(xì)胞密度不再增加，這一現(xiàn)象稱之為接觸抑制或密度依賴抑制現(xiàn)象。在 一定條件下，可轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細(xì)胞 型。 增殖 分化 活體內(nèi)的動(dòng)物細(xì)胞按照分裂能力可以分為三大類： 第一類是能保持繼續(xù)分裂能力的細(xì)胞，可以繼續(xù)不斷地分裂，如骨髓干細(xì)胞、各類前體細(xì)胞； 第二
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