【正文】 的小單室脂質(zhì)體，在凍干前將待包封的藥物加入，在快速冷凍過程中，由于冰晶的形成，使形成的脂質(zhì)體膜破裂，形成冰晶的片層與破碎的膜同時存在，此狀態(tài)不穩(wěn)定，在緩慢融化過程中，暴露出的脂膜互相融合重新形成脂質(zhì)體。 1．薄膜分散法：磷脂與膽固醇等類脂質(zhì)及脂溶性藥物溶于氯仿（或其它有機溶劑）中，將該氯仿液于玻璃瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā) ,使在玻璃瓶的內(nèi)壁上形成一薄膜；將水溶性藥物溶于磷酸鹽緩沖液中，加入玻璃瓶后不斷攪拌，即得。這些方法包括 [6]： ① 膠束聚合法（ Micell polymerization method）：就是將聚合物水溶性單體及藥物溶解于水中，與表面活性劑存在下經(jīng)攪拌分散至大量疏水介質(zhì)中（如正己烷），然后加入引發(fā)劑或在 γ 射線、 X射線、紫外光或可見光照射下發(fā)生聚合而得。 1）滴 /min 的速度滴入預(yù)熱振蕩的棉籽油中，振蕩加熱維持 10min，然后置于冰塊中冷卻至25℃ , 用 60mL 無水乙醚洗滌 4 次，磁性納米粒經(jīng)凍干，在 4℃儲存?zhèn)溆?。在靶部位釋放藥物的速度適宜，保證在該部位能夠釋放出大部分藥物。可以設(shè)想，隨著納米科技的進展和納米生物新材料的不斷出現(xiàn)，磁性納米粒將給生物醫(yī)藥帶來新的變革和快速的發(fā)展。 230 第 8 章 磁性納米載體 磁性納米粒（ Magic Nanomaterials）是指大小在納米尺度的磁性材料，如三氧化二鐵或四氧化三鐵的納米粒。有的磁性載藥系統(tǒng)已進入臨床研究階段；有更多的磁性納米粒以及磁性載體系統(tǒng)正處于不同的試驗研究階段。 ⑤ 系統(tǒng)應(yīng)具有足夠的載藥能力（ Loading capacity），具有一定的機械強度和生物降解速度。取棉籽油 100mL 并加熱至 100℃ ~150℃之間，加熱后置于 1500rpm 的加熱振蕩器上，維持溫度進行振蕩，將超聲后的混懸液以（ 100177。 此外制備普通納米粒的方法也可以借鑒用以制備磁性納米粒，只是在適當?shù)臅r候加入磁性納米粒。 制備脂質(zhì)體的方法原則都可用于制備磁性脂質(zhì)體。另外，還可使用重建凍干法制備脂質(zhì)體，將類脂乙醇液與PBS 混合并制成空白脂質(zhì)體，滅菌、超聲波粉碎，加入藥物和凍結(jié)保護劑，冷凍干燥 ,即得。 9．表面活性劑處理法：脂質(zhì)薄膜、多層脂質(zhì)體或單層脂質(zhì)體與膽酸鹽、脫氧膽酸鹽等表面活性劑混合，通過離心法或凝膠過濾法或透析法除去表面活性劑，就可獲得中等大小的單層脂質(zhì)體。將卵磷脂和α 維生素 E（ tocopherol）適量溶解于氯仿中，而 Fe3O4 納米粒則混懸于甲醇中，同時加入 14C膽固醇作為內(nèi)標物，將上述體系混合超聲分散，除去有機溶劑后形成含有 Fe3O4 納米材料的脂質(zhì)薄膜，而后加入含有 3H菊粉（ inulin）的 PBS 水化脂質(zhì)膜，經(jīng)柱分離得到了平均粒徑為 m的磁性脂質(zhì)體。有天然的也有合成的，可以單獨應(yīng)用也可以合用作骨架材料。所制硅烷磁性微球可以分散在水性介質(zhì)中，而不會快速沉淀，可用磁場方便地進行回收。 微球與抗體的連接有吸附結(jié)合與共價結(jié)合兩種形式，吸附結(jié)合依靠微球表面對抗體的非特異吸附力，而共價結(jié)合依靠微球表面的活性基團與抗體共價反應(yīng)。 一般理化特性的檢測 可采用 U 型管電泳法測定樣品表面動電位；按照最大泡壓法測定樣品表面張力；在一定波長處測定樣品溶液的吸收度，從 而判定樣品的濁度，后者可在一定程度上反映納米材料的分散性；采用烏氏粘度計或轉(zhuǎn)筒粘度計等裝置測定樣品的粘度；使用阿貝折射儀測定折射率；采用比重天平儀測定樣品溶液的密度；使用酸度計測定樣品的 pH 值，等等。 質(zhì)量磁化率和磁化強度 采用法拉第天平測定樣品的質(zhì)量磁化率（ Xm） ,結(jié)果應(yīng)該符合實驗要求。如采用蠕動泵控制流速（ 3L/h），使制劑通過平行多口裝置，相鄰的出口距離為 2cm，一側(cè)靠近一個一定強度的磁場，分別收集在磁場作用下每個出口吸附及未吸附制劑的量，干燥后稱重。 X 衍射測定 用 X 衍射測定儀可以分析磁性納米粒的結(jié)構(gòu)，判定磁性物質(zhì)的類型等。一般包括化學(xué)穩(wěn)定性、物理穩(wěn)定性和生物學(xué)穩(wěn)定性三方面。 磁性納米載體在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用 作為抗癌藥物載體的應(yīng)用 通常而言，治療物質(zhì)都普遍存在毒副作用，而抗 腫瘤藥物則更是存在嚴重的全身毒副作用，因而長期以來人們就期望能夠?qū)⒅委熚镔|(zhì)特異性的遞送到特定的病變組織或器官，實現(xiàn)局部病變（ Local diseases）局部治療（ Local therapy）的目的。其中磁性微球可以看作是由磁性納米粒與高分子骨架材料制備而成，而且作為抗癌藥物的載體研究較多 [1316]。 磁性納米?？梢杂糜谳d藥磁性納米?；蜉d藥磁性脂質(zhì)體的制備。組織解剖或磁共振成像都證實了磁性納米粒存在于腫瘤組織中。結(jié)果病人對表阿霉素磁性納米粒耐受良好。目前的研究表明，單純的含有 Fe3O4 的脂質(zhì)體就可以應(yīng)用于腫瘤的局部升溫治療，并且有望成為腫瘤治療的新手段。 1．超順磁性氧化鐵納米粒的一般性能 科學(xué)家 從 80 年代以來對超順磁性氧化鐵進行了廣泛 、深入的研究，在動物實驗和臨床試驗的基礎(chǔ)上，開發(fā)了一系列不同的 SPIO 產(chǎn)品。但臨床上目前用得較多的是 Advanced Magics 公司開發(fā)的 AMI25（ Ferumoxides，商品名為 Feridex），直徑為（ 50?29） nm，其核心氧化鐵納米粒的直徑約為 20nm。吞噬細胞吞噬超順磁性氧化鐵顆粒后使相應(yīng)區(qū)域信號減低，而腫瘤組織因不含正常的吞噬細胞而保持信號不變。正常人每克肝組織內(nèi)鐵含量達到 200μ g 時，就會發(fā)展成為肝硬化和肝細胞癌；另一方面，人體內(nèi)鐵的總量達 15g 以上時，就會出現(xiàn)亞急性和慢性中毒反應(yīng)。有人報道副作用的發(fā)生率為 20%，包括：心動過速、心率不齊、熱感、腰腹痛、頭痛、臉紅、低血壓等，但都比較輕微，可在 25min 內(nèi)自行恢復(fù)。 5．超順磁性氧化鐵在磁共振成像中的臨床應(yīng)用 (1) 肝癌的檢出和診斷 用超順磁性氧化鐵進行肝癌的檢出與診斷的原量在于：超順磁性氧化鐵納米粒在體內(nèi)被吞噬細胞攝取后，主要存在于富含吞噬細胞的正常肝組織中，使正常肝組織的 T2WI 信號減弱， 而肝轉(zhuǎn)移瘤和原發(fā)性肝細胞癌等惡性肝腫瘤組織中都缺乏吞噬細胞， T2WI 信號不降低，因此出現(xiàn)相對的高信號區(qū)，這樣就增加了肝癌組織與肝正常組織之間的對比度。 (3) 在肝磁共振血管成像（ MRA）中的應(yīng)用 有人對臨床疑診肝細胞癌的病人靜注 SHU 555A， 然后通過計算機重建得到了三維 MRA 影像，結(jié)果圖像上清楚地顯示了肝細胞癌、門脈及肝靜脈。 FeOBPA 是 一種直徑小于＜ 20nm 的新型 242 USPIOs 血池對比劑，比 AMI227 的 R2/R1 值更低， T1 效應(yīng)更強，可能更適用于 MRA。脂質(zhì)體作為一種藥物載體，在磁共振造影中應(yīng)用可以降低造影劑的毒性，并依其顆粒的大小將造影劑變成網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)造影劑或血池造影劑。 用于細胞分離的免疫磁性微球應(yīng)具備以下條件：化學(xué)性能穩(wěn)定，不產(chǎn)生凝聚；不與細胞發(fā)生非特異性的結(jié)合；磁性微球與抗體的結(jié)合牢固；磁性微球的大小均勻，磁響應(yīng)性好，磁性納米粒的含量均勻一致；磁性微球大小適當，不易被細胞所吞噬。 針對單核細胞的單克隆抗體的發(fā)展使得分離帶有特異表面標記的細胞成為可能。解鏈、提取、雜交（用堿或升溫 ） 等都不會干擾DNA 和磁珠之間的連接。這種方法特別適于自動化，可以很快地制備大量樣品，供應(yīng)給裝有加熱 /冷卻系統(tǒng)的 工作站進行測序。 3．免疫磁性微球在微生物學(xué)上的應(yīng)用 免疫磁珠在微生物學(xué)上也有廣泛的用途，通過免疫反應(yīng)結(jié)合于磁珠上的微生物通常可保持活性，提供給適當?shù)臓I養(yǎng)就可以大量擴增 [32]。陽性率高于 ISO， IMSPlating， SalmonellaTek ELISA 等方法。應(yīng)用 IMBPCR 進行檢測的微生物包括：牙齦卟啉單孢菌、小腸結(jié)腸炎耶爾氏菌、沙門氏菌、幽門螺桿菌等。 4．免疫磁性微球在自身骨髓移植中的應(yīng)用 在過去 l0 多年中，高劑量化療后給予自身骨髓移植（朋 MT）已經(jīng)成為某些患有急性白血病、何杰金氏病或非何杰金氏淋巴瘤（ NHL）、神經(jīng)母細胞瘤及 wilms 腫瘤的可選療法。自免疫磁性微球問世以來，至今已經(jīng)應(yīng)用于幾乎所有的需要進行骨髓凈化的癌癥類型。結(jié)果表明，在有核骨髓細胞中混有 1％的神經(jīng)母細胞瘤細胞（ cell line CHPl00） 時，用 IMMS可清除掉 ％的腫瘤細胞。 l 例 4 個月后復(fù)發(fā)，另 l 例在 5 個月后依然處于緩解期。 (3) 用于清除白血病細胞 KorblingLl 等人收集了 3 例復(fù)發(fā)的急性淋巴細胞白血?。?ALL）患者的骨髓，收集時間為二次緩解期的早期。免疫磁性清除過程包括一次與三種單抗（ CDlO、 CDl CD22）的培養(yǎng)，兩次與磁性微球的培養(yǎng)。結(jié)果表明，免疫磁性分離后運用 40μ g/mL 的 4HC 清除殘余的癌細胞可獲得 個對數(shù)級的癌細胞清除率。 CottlerFox 等采用反相分離技術(shù)，即用聯(lián)有二抗的免疫磁珠和抗 CD3，CD4， CDl4， CDl6 的單克隆抗體清除掉所有非干細胞。Hanen 和 Hannestad 更發(fā)展了應(yīng)用免疫磁珠的直接分型方法。分離后， B 細胞直接用 EpsteinBarr 病毒轉(zhuǎn)化，大量擴增，隨后檢測抗體的產(chǎn)生情況。這些細胞往往不易勻漿。 Vigano 發(fā)現(xiàn)，這種方法可以清除掉 50%的 IgA 標記的精子，精子運動和完整性實驗證明磁珠對精子的性質(zhì)沒有影響。其余 18 例中， 16 或 18人沒有復(fù)發(fā)（中期檢查： 16 月，范圍 742 月）。磁導(dǎo)向脂質(zhì)體的應(yīng)用將提高基因傳遞的靶向性，從面提高轉(zhuǎn)染效率。但目前能夠滿足上述要求的磁性藥物載體還不多，并且有關(guān)磁性介質(zhì)體內(nèi)蓄積、代謝、排泄等問題還尚待深入研究。另有報道含有 75%~80%鐵氧化物的超順磁性多糖納米粒子（ 200nm~400nm）與納米尺寸的二氧化硅相互作用，可以提高顆粒基體的強度 ，它可以應(yīng)用于 DNA 自動提純，蛋白質(zhì)檢測、分離和提純，生物物料中逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測，內(nèi)病毒清除和雌性細胞分離等。目前已有人將 RNA、 DNA 這些遺傳基因包載在陽離子脂質(zhì)體中，并進行了臨床研究與評價，這為基因治療提供了新的途徑和方法。首先用聯(lián)有抗上皮細胞抗體的免疫磁珠從血液中分離出癌細胞，用 PCRRFLP 檢測細胞 kras 基因的第 12 密碼子的突變情況。這種方式可以避免對所要分離的膜泡的損傷，因為它省去了反復(fù)濃集和重新懸浮的的過程。其它的應(yīng)用還包括分離滋養(yǎng)層細胞、嗜酸性細胞、郎罕氏細胞、NK 細胞、內(nèi)皮細胞等 等。用免疫磁珠分離出 CD2+， CD4+， CD8+， CDl9+后用血球計數(shù)板測定形成花環(huán)的靶細胞數(shù)目，這種方法可用于臨床檢測 AIDS 病人的 T4 和 T8 的比例。應(yīng)用免疫磁性微球分離造血干細胞的文獻非常多，如 Law， Silvestri，Nakamura， Bigas 等等。用此方法清除了三個數(shù)量級的 T 細胞。 (4) 在其它腫瘤的骨髓凈化中的應(yīng)用 Ball、 Myklebust 等人將 IMMS 應(yīng)用于小細胞肺癌病人的自身骨髓移植。三人在術(shù)后的無病存活期分別為 2 2 27 個月。對123 例患神經(jīng)母細胞瘤的兒童病人在自身骨髓移植時應(yīng)用免疫磁性微球進行骨髓凈化，結(jié)果表明：該過程會導(dǎo)致單核細胞的顯著損失，但對骨髓造血細胞無毒。首先，將骨髓與 4 種單克隆抗體（ CDl0、CDl CD CD 22）一起培養(yǎng)，再與包有二抗的 磁性微球一起培養(yǎng)，最后通過分離裝置。清除過程為：將磁性微球與 IgGl 族的 6 個單克隆抗體（ UJl3A、 、 、 、Thyl 和 H11）在 4℃、不斷振搖狀態(tài)下培養(yǎng) 30min，離心 l0min，用磷酸鹽緩沖液及 5％ PPF（ purified protein faction）洗滌除去所有沒有與細胞結(jié)合的抗體。體外凈化骨髓已發(fā)展起來多種方法。如果在靶區(qū)加入內(nèi)標乳糖操縱子，然后同時擴增，即可進行定量分析。在應(yīng)用 PCR 前先用免疫磁珠進行處理就可以解決這個問題。 結(jié)合于磁珠上的細菌可以直接在顯微鏡下進行分析，如對脆弱鏈泡囊菌、大腸桿菌 O157： H沙門氏菌等的檢測；也可以與其它檢測方法結(jié)合起來進行分析。 (5) 體外誘變 體外誘變有很多方法，大部分采用核苷酸介導(dǎo)的誘變，可以使 DNA 特定部位精確改變。 Gabrielsen 等用親和磁珠 純化 DNA 結(jié)合蛋白（酪母轉(zhuǎn)錄因子 IIIC），通過磁性分離，洗滌和沉脫，可以得到高純蛋白，三次吸附過程僅用 1hr。相對而言，免疫磁性微球具有操作簡便、分離迅速完全、細胞純度高等優(yōu)點，尤其在操作簡便省時方面，其它分離方法很難比擬。使磁性微球間接地與靶細胞結(jié)合。免疫磁性納米粒和免疫磁性微球的應(yīng)用有很多相似之處。從這個意義上講， USPIOs 可能更適合作 MRA 對比劑。 有人用三種劑量的 AMI227 在 16 例病人身上進行了臨床試驗。腫瘤細胞也可攝入超順磁性氧化鐵納米粒，并且特征性地在腫瘤部位表現(xiàn)為 T1WI 信號增強，而 T2WI 信號降低，故可與其它良性肝臟腫瘤相區(qū)別。 由于其特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)，超順磁性氧化鐵納米粒即使在較弱的磁場中也可產(chǎn)生較大的磁性，而外磁場撤消后磁性也迅速消失，即具有所謂超順磁性。在小鼠模型上應(yīng)用 AMI25達到 3000μ mol Fe/kg，也未見明顯的急性中毒反應(yīng)。 USPIOs 由于顆粒小，主要進入淋巴結(jié)組織及骨髓組織中。粒度的改變使 USPIOs 具有一些特殊的性能。根據(jù) SPIO 產(chǎn)品的顆粒大小可分