【正文】 的小單室脂質(zhì)體，在凍干前將待包封的藥物加入，在快速冷凍過(guò)程中，由于冰晶的形成，使形成的脂質(zhì)體膜破裂，形成冰晶的片層與破碎的膜同時(shí)存在，此狀態(tài)不穩(wěn)定，在緩慢融化過(guò)程中，暴露出的脂膜互相融合重新形成脂質(zhì)體。 1．薄膜分散法：磷脂與膽固醇等類脂質(zhì)及脂溶性藥物溶于氯仿（或其它有機(jī)溶劑）中，將該氯仿液于玻璃瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā) ,使在玻璃瓶的內(nèi)壁上形成一薄膜；將水溶性藥物溶于磷酸鹽緩沖液中，加入玻璃瓶后不斷攪拌，即得。這些方法包括 [6]： ① 膠束聚合法（ Micell polymerization method）：就是將聚合物水溶性單體及藥物溶解于水中，與表面活性劑存在下經(jīng)攪拌分散至大量疏水介質(zhì)中（如正己烷），然后加入引發(fā)劑或在 γ 射線、 X射線、紫外光或可見光照射下發(fā)生聚合而得。 1）滴 /min 的速度滴入預(yù)熱振蕩的棉籽油中，振蕩加熱維持 10min，然后置于冰塊中冷卻至25℃ , 用 60mL 無(wú)水乙醚洗滌 4 次，磁性納米粒經(jīng)凍干，在 4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｔ诎胁课会尫潘幬锏乃俣冗m宜，保證在該部位能夠釋放出大部分藥物?？梢栽O(shè)想，隨著納米科技的進(jìn)展和納米生物新材料的不斷出現(xiàn)，磁性納米粒將給生物醫(yī)藥帶來(lái)新的變革和快速的發(fā)展。 230 第 8 章 磁性納米載體 磁性納米粒（ Magic Nanomaterials）是指大小在納米尺度的磁性材料，如三氧化二鐵或四氧化三鐵的納米粒。有的磁性載藥系統(tǒng)已進(jìn)入臨床研究階段；有更多的磁性納米粒以及磁性載體系統(tǒng)正處于不同的試驗(yàn)研究階段。 ⑤ 系統(tǒng)應(yīng)具有足夠的載藥能力（ Loading capacity），具有一定的機(jī)械強(qiáng)度和生物降解速度。取棉籽油 100mL 并加熱至 100℃ ~150℃之間，加熱后置于 1500rpm 的加熱振蕩器上，維持溫度進(jìn)行振蕩，將超聲后的混懸液以（ 100177。 此外制備普通納米粒的方法也可以借鑒用以制備磁性納米粒，只是在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候加入磁性納米粒。 制備脂質(zhì)體的方法原則都可用于制備磁性脂質(zhì)體。另外，還可使用重建凍干法制備脂質(zhì)體，將類脂乙醇液與PBS 混合并制成空白脂質(zhì)體，滅菌、超聲波粉碎，加入藥物和凍結(jié)保護(hù)劑，冷凍干燥 ,即得。 9．表面活性劑處理法：脂質(zhì)薄膜、多層脂質(zhì)體或單層脂質(zhì)體與膽酸鹽、脫氧膽酸鹽等表面活性劑混合，通過(guò)離心法或凝膠過(guò)濾法或透析法除去表面活性劑，就可獲得中等大小的單層脂質(zhì)體。將卵磷脂和α 維生素 E（ tocopherol）適量溶解于氯仿中，而 Fe3O4 納米粒則混懸于甲醇中，同時(shí)加入 14C膽固醇作為內(nèi)標(biāo)物，將上述體系混合超聲分散，除去有機(jī)溶劑后形成含有 Fe3O4 納米材料的脂質(zhì)薄膜，而后加入含有 3H菊粉（ inulin）的 PBS 水化脂質(zhì)膜，經(jīng)柱分離得到了平均粒徑為 m的磁性脂質(zhì)體。有天然的也有合成的，可以單獨(dú)應(yīng)用也可以合用作骨架材料。所制硅烷磁性微球可以分散在水性介質(zhì)中，而不會(huì)快速沉淀，可用磁場(chǎng)方便地進(jìn)行回收。 微球與抗體的連接有吸附結(jié)合與共價(jià)結(jié)合兩種形式，吸附結(jié)合依靠微球表面對(duì)抗體的非特異吸附力，而共價(jià)結(jié)合依靠微球表面的活性基團(tuán)與抗體共價(jià)反應(yīng)。 一般理化特性的檢測(cè) 可采用 U 型管電泳法測(cè)定樣品表面動(dòng)電位；按照最大泡壓法測(cè)定樣品表面張力；在一定波長(zhǎng)處測(cè)定樣品溶液的吸收度，從 而判定樣品的濁度，后者可在一定程度上反映納米材料的分散性；采用烏氏粘度計(jì)或轉(zhuǎn)筒粘度計(jì)等裝置測(cè)定樣品的粘度；使用阿貝折射儀測(cè)定折射率；采用比重天平儀測(cè)定樣品溶液的密度；使用酸度計(jì)測(cè)定樣品的 pH 值，等等。 質(zhì)量磁化率和磁化強(qiáng)度 采用法拉第天平測(cè)定樣品的質(zhì)量磁化率（ Xm） ,結(jié)果應(yīng)該符合實(shí)驗(yàn)要求。如采用蠕動(dòng)泵控制流速（ 3L/h），使制劑通過(guò)平行多口裝置，相鄰的出口距離為 2cm，一側(cè)靠近一個(gè)一定強(qiáng)度的磁場(chǎng)，分別收集在磁場(chǎng)作用下每個(gè)出口吸附及未吸附制劑的量，干燥后稱重。 X 衍射測(cè)定 用 X 衍射測(cè)定儀可以分析磁性納米粒的結(jié)構(gòu)，判定磁性物質(zhì)的類型等。一般包括化學(xué)穩(wěn)定性、物理穩(wěn)定性和生物學(xué)穩(wěn)定性三方面。 磁性納米載體在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用 作為抗癌藥物載體的應(yīng)用 通常而言，治療物質(zhì)都普遍存在毒副作用，而抗 腫瘤藥物則更是存在嚴(yán)重的全身毒副作用，因而長(zhǎng)期以來(lái)人們就期望能夠?qū)⒅委熚镔|(zhì)特異性的遞送到特定的病變組織或器官，實(shí)現(xiàn)局部病變（ Local diseases）局部治療（ Local therapy）的目的。其中磁性微球可以看作是由磁性納米粒與高分子骨架材料制備而成，而且作為抗癌藥物的載體研究較多 [1316]。 磁性納米粒可以用于載藥磁性納米?；蜉d藥磁性脂質(zhì)體的制備。組織解剖或磁共振成像都證實(shí)了磁性納米粒存在于腫瘤組織中。結(jié)果病人對(duì)表阿霉素磁性納米粒耐受良好。目前的研究表明，單純的含有 Fe3O4 的脂質(zhì)體就可以應(yīng)用于腫瘤的局部升溫治療，并且有望成為腫瘤治療的新手段。 1．超順磁性氧化鐵納米粒的一般性能 科學(xué)家 從 80 年代以來(lái)對(duì)超順磁性氧化鐵進(jìn)行了廣泛 、深入的研究，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，開發(fā)了一系列不同的 SPIO 產(chǎn)品。但臨床上目前用得較多的是 Advanced Magics 公司開發(fā)的 AMI25（ Ferumoxides，商品名為 Feridex），直徑為（ 50?29） nm，其核心氧化鐵納米粒的直徑約為 20nm。吞噬細(xì)胞吞噬超順磁性氧化鐵顆粒后使相應(yīng)區(qū)域信號(hào)減低，而腫瘤組織因不含正常的吞噬細(xì)胞而保持信號(hào)不變。正常人每克肝組織內(nèi)鐵含量達(dá)到 200μ g 時(shí)，就會(huì)發(fā)展成為肝硬化和肝細(xì)胞癌；另一方面，人體內(nèi)鐵的總量達(dá) 15g 以上時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)亞急性和慢性中毒反應(yīng)。有人報(bào)道副作用的發(fā)生率為 20%，包括：心動(dòng)過(guò)速、心率不齊、熱感、腰腹痛、頭痛、臉紅、低血壓等，但都比較輕微，可在 25min 內(nèi)自行恢復(fù)。 5．超順磁性氧化鐵在磁共振成像中的臨床應(yīng)用 (1) 肝癌的檢出和診斷 用超順磁性氧化鐵進(jìn)行肝癌的檢出與診斷的原量在于：超順磁性氧化鐵納米粒在體內(nèi)被吞噬細(xì)胞攝取后，主要存在于富含吞噬細(xì)胞的正常肝組織中，使正常肝組織的 T2WI 信號(hào)減弱， 而肝轉(zhuǎn)移瘤和原發(fā)性肝細(xì)胞癌等惡性肝腫瘤組織中都缺乏吞噬細(xì)胞， T2WI 信號(hào)不降低，因此出現(xiàn)相對(duì)的高信號(hào)區(qū)，這樣就增加了肝癌組織與肝正常組織之間的對(duì)比度。 (3) 在肝磁共振血管成像（ MRA）中的應(yīng)用 有人對(duì)臨床疑診肝細(xì)胞癌的病人靜注 SHU 555A， 然后通過(guò)計(jì)算機(jī)重建得到了三維 MRA 影像，結(jié)果圖像上清楚地顯示了肝細(xì)胞癌、門脈及肝靜脈。 FeOBPA 是 一種直徑小于＜ 20nm 的新型 242 USPIOs 血池對(duì)比劑，比 AMI227 的 R2/R1 值更低， T1 效應(yīng)更強(qiáng)，可能更適用于 MRA。脂質(zhì)體作為一種藥物載體，在磁共振造影中應(yīng)用可以降低造影劑的毒性，并依其顆粒的大小將造影劑變成網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)造影劑或血池造影劑。 用于細(xì)胞分離的免疫磁性微球應(yīng)具備以下條件：化學(xué)性能穩(wěn)定，不產(chǎn)生凝聚；不與細(xì)胞發(fā)生非特異性的結(jié)合；磁性微球與抗體的結(jié)合牢固；磁性微球的大小均勻，磁響應(yīng)性好，磁性納米粒的含量均勻一致；磁性微球大小適當(dāng)，不易被細(xì)胞所吞噬。 針對(duì)單核細(xì)胞的單克隆抗體的發(fā)展使得分離帶有特異表面標(biāo)記的細(xì)胞成為可能。解鏈、提取、雜交（用堿或升溫 ） 等都不會(huì)干擾DNA 和磁珠之間的連接。這種方法特別適于自動(dòng)化，可以很快地制備大量樣品，供應(yīng)給裝有加熱 /冷卻系統(tǒng)的 工作站進(jìn)行測(cè)序。 3．免疫磁性微球在微生物學(xué)上的應(yīng)用 免疫磁珠在微生物學(xué)上也有廣泛的用途，通過(guò)免疫反應(yīng)結(jié)合于磁珠上的微生物通常可保持活性，提供給適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)就可以大量擴(kuò)增 [32]。陽(yáng)性率高于 ISO， IMSPlating， SalmonellaTek ELISA 等方法。應(yīng)用 IMBPCR 進(jìn)行檢測(cè)的微生物包括：牙齦卟啉單孢菌、小腸結(jié)腸炎耶爾氏菌、沙門氏菌、幽門螺桿菌等。 4．免疫磁性微球在自身骨髓移植中的應(yīng)用 在過(guò)去 l0 多年中，高劑量化療后給予自身骨髓移植（朋 MT）已經(jīng)成為某些患有急性白血病、何杰金氏病或非何杰金氏淋巴瘤（ NHL）、神經(jīng)母細(xì)胞瘤及 wilms 腫瘤的可選療法。自免疫磁性微球問世以來(lái)，至今已經(jīng)應(yīng)用于幾乎所有的需要進(jìn)行骨髓凈化的癌癥類型。結(jié)果表明，在有核骨髓細(xì)胞中混有 1％的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（ cell line CHPl00） 時(shí)，用 IMMS可清除掉 ％的腫瘤細(xì)胞。 l 例 4 個(gè)月后復(fù)發(fā)，另 l 例在 5 個(gè)月后依然處于緩解期。 (3) 用于清除白血病細(xì)胞 KorblingLl 等人收集了 3 例復(fù)發(fā)的急性淋巴細(xì)胞白血病（ ALL）患者的骨髓，收集時(shí)間為二次緩解期的早期。免疫磁性清除過(guò)程包括一次與三種單抗（ CDlO、 CDl CD22）的培養(yǎng)，兩次與磁性微球的培養(yǎng)。結(jié)果表明，免疫磁性分離后運(yùn)用 40μ g/mL 的 4HC 清除殘余的癌細(xì)胞可獲得 個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)的癌細(xì)胞清除率。 CottlerFox 等采用反相分離技術(shù)，即用聯(lián)有二抗的免疫磁珠和抗 CD3，CD4， CDl4， CDl6 的單克隆抗體清除掉所有非干細(xì)胞。Hanen 和 Hannestad 更發(fā)展了應(yīng)用免疫磁珠的直接分型方法。分離后， B 細(xì)胞直接用 EpsteinBarr 病毒轉(zhuǎn)化，大量擴(kuò)增，隨后檢測(cè)抗體的產(chǎn)生情況。這些細(xì)胞往往不易勻漿。 Vigano 發(fā)現(xiàn)，這種方法可以清除掉 50%的 IgA 標(biāo)記的精子，精子運(yùn)動(dòng)和完整性實(shí)驗(yàn)證明磁珠對(duì)精子的性質(zhì)沒有影響。其余 18 例中， 16 或 18人沒有復(fù)發(fā)（中期檢查： 16 月，范圍 742 月）。磁導(dǎo)向脂質(zhì)體的應(yīng)用將提高基因傳遞的靶向性，從面提高轉(zhuǎn)染效率。但目前能夠滿足上述要求的磁性藥物載體還不多，并且有關(guān)磁性介質(zhì)體內(nèi)蓄積、代謝、排泄等問題還尚待深入研究。另有報(bào)道含有 75%~80%鐵氧化物的超順磁性多糖納米粒子（ 200nm~400nm）與納米尺寸的二氧化硅相互作用，可以提高顆?；w的強(qiáng)度 ，它可以應(yīng)用于 DNA 自動(dòng)提純，蛋白質(zhì)檢測(cè)、分離和提純，生物物料中逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測(cè)，內(nèi)病毒清除和雌性細(xì)胞分離等。目前已有人將 RNA、 DNA 這些遺傳基因包載在陽(yáng)離子脂質(zhì)體中，并進(jìn)行了臨床研究與評(píng)價(jià)，這為基因治療提供了新的途徑和方法。首先用聯(lián)有抗上皮細(xì)胞抗體的免疫磁珠從血液中分離出癌細(xì)胞，用 PCRRFLP 檢測(cè)細(xì)胞 kras 基因的第 12 密碼子的突變情況。這種方式可以避免對(duì)所要分離的膜泡的損傷，因?yàn)樗∪チ朔磸?fù)濃集和重新懸浮的的過(guò)程。其它的應(yīng)用還包括分離滋養(yǎng)層細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、郎罕氏細(xì)胞、NK 細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等 等。用免疫磁珠分離出 CD2+， CD4+， CD8+， CDl9+后用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定形成花環(huán)的靶細(xì)胞數(shù)目，這種方法可用于臨床檢測(cè) AIDS 病人的 T4 和 T8 的比例。應(yīng)用免疫磁性微球分離造血干細(xì)胞的文獻(xiàn)非常多，如 Law， Silvestri，Nakamura， Bigas 等等。用此方法清除了三個(gè)數(shù)量級(jí)的 T 細(xì)胞。 (4) 在其它腫瘤的骨髓凈化中的應(yīng)用 Ball、 Myklebust 等人將 IMMS 應(yīng)用于小細(xì)胞肺癌病人的自身骨髓移植。三人在術(shù)后的無(wú)病存活期分別為 2 2 27 個(gè)月。對(duì)123 例患神經(jīng)母細(xì)胞瘤的兒童病人在自身骨髓移植時(shí)應(yīng)用免疫磁性微球進(jìn)行骨髓凈化，結(jié)果表明：該過(guò)程會(huì)導(dǎo)致單核細(xì)胞的顯著損失，但對(duì)骨髓造血細(xì)胞無(wú)毒。首先，將骨髓與 4 種單克隆抗體（ CDl0、CDl CD CD 22）一起培養(yǎng)，再與包有二抗的 磁性微球一起培養(yǎng)，最后通過(guò)分離裝置。清除過(guò)程為：將磁性微球與 IgGl 族的 6 個(gè)單克隆抗體（ UJl3A、 、 、 、Thyl 和 H11）在 4℃、不斷振搖狀態(tài)下培養(yǎng) 30min，離心 l0min，用磷酸鹽緩沖液及 5％ PPF（ purified protein faction）洗滌除去所有沒有與細(xì)胞結(jié)合的抗體。體外凈化骨髓已發(fā)展起來(lái)多種方法。如果在靶區(qū)加入內(nèi)標(biāo)乳糖操縱子，然后同時(shí)擴(kuò)增，即可進(jìn)行定量分析。在應(yīng)用 PCR 前先用免疫磁珠進(jìn)行處理就可以解決這個(gè)問題。 結(jié)合于磁珠上的細(xì)菌可以直接在顯微鏡下進(jìn)行分析，如對(duì)脆弱鏈泡囊菌、大腸桿菌 O157： H沙門氏菌等的檢測(cè)；也可以與其它檢測(cè)方法結(jié)合起來(lái)進(jìn)行分析。 (5) 體外誘變 體外誘變有很多方法，大部分采用核苷酸介導(dǎo)的誘變，可以使 DNA 特定部位精確改變。 Gabrielsen 等用親和磁珠 純化 DNA 結(jié)合蛋白（酪母轉(zhuǎn)錄因子 IIIC），通過(guò)磁性分離，洗滌和沉脫，可以得到高純蛋白，三次吸附過(guò)程僅用 1hr。相對(duì)而言，免疫磁性微球具有操作簡(jiǎn)便、分離迅速完全、細(xì)胞純度高等優(yōu)點(diǎn)，尤其在操作簡(jiǎn)便省時(shí)方面，其它分離方法很難比擬。使磁性微球間接地與靶細(xì)胞結(jié)合。免疫磁性納米粒和免疫磁性微球的應(yīng)用有很多相似之處。從這個(gè)意義上講， USPIOs 可能更適合作 MRA 對(duì)比劑。 有人用三種劑量的 AMI227 在 16 例病人身上進(jìn)行了臨床試驗(yàn)。腫瘤細(xì)胞也可攝入超順磁性氧化鐵納米粒，并且特征性地在腫瘤部位表現(xiàn)為 T1WI 信號(hào)增強(qiáng)，而 T2WI 信號(hào)降低，故可與其它良性肝臟腫瘤相區(qū)別。 由于其特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)，超順磁性氧化鐵納米粒即使在較弱的磁場(chǎng)中也可產(chǎn)生較大的磁性，而外磁場(chǎng)撤消后磁性也迅速消失，即具有所謂超順磁性。在小鼠模型上應(yīng)用 AMI25達(dá)到 3000μ mol Fe/kg，也未見明顯的急性中毒反應(yīng)。 USPIOs 由于顆粒小，主要進(jìn)入淋巴結(jié)組織及骨髓組織中。粒度的改變使 USPIOs 具有一些特殊的性能。根據(jù) SPIO 產(chǎn)品的顆粒大小可分