【正文】 ,第七十四頁，共一百一十二頁。 （2）接觸抑制：培養(yǎng)一段時間后，細胞增多成片 后，運動和生長受到抑制。,第七十七頁，共一百一十二頁。,第七十八頁，共一百一十二頁。ngh233。bāo)富含肌原纖維具收縮能力，故培 養(yǎng)方法上有其特殊性。,第八十二頁，共一百一十二頁。（不同組織來源的細胞連續(xù)傳 代會導(dǎo)致生長增殖活動停止，也有肌源性表型喪失的趨勢）,第八十四頁，共一百一十二頁。,第八十五頁，共一百一十二頁。 硼酸鹽緩沖液配制的多聚賴氨酸生長基質(zhì)，其效果好于 蒸餾水。,4.4 .1 器官(q236。 （2）被培養(yǎng)物是完整器官或具有完整功能的某一 器官的一部分。nɡ tǐ)器官培養(yǎng)的特點,基本原則： （1）提供充足的營養(yǎng)和O2，及時排除代謝廢物； （2）抑制細胞從植快向外遷移。 （２）只能成功培養(yǎng)幾周，且僅能維持其存活和保 持其結(jié)構(gòu)功能（因其高耗氧率和細胞的高度分化）。 已成功用于研究胚胎原基的形態(tài)發(fā)生，改良后可用 于激素、維生素、致癌因子對哺乳動物成年器官的作 用等方面的研究。guān)培養(yǎng)方法,懸浮培養(yǎng)法： 是最簡便最早使用的液體培養(yǎng)法，可隨時加影響因 子或生化分析（瓊脂凝膠培養(yǎng)法只有在轉(zhuǎn)培養(yǎng)時才能 進行）。 此法適合于高耗氧的成體器官的培養(yǎng)。,第九十七頁，共一百一十二頁。,4.4.3 傳統(tǒng)(chu225。ntǒng)的器官培養(yǎng)方法,旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法： 最早于1933年（Gey）建立。 1976年（Barret等）創(chuàng)立搖擺式器官培養(yǎng)法：采 用平臺式搖擺儀使培養(yǎng)的器官植塊交替(jiāot236。樣 品從樣品收集口收集。,第一百零三頁，共一百一十二頁。軟骨培養(yǎng)可采用旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法、 血漿凝塊培養(yǎng)法和金屬格柵培養(yǎng)法。 4. 將股骨植塊植于培養(yǎng)管的血漿上，每隔約15分 鐘可放入一個股骨，加塞，室溫靜止1~2小時。 2. 剪開鼠胎的顱蓋骨，取出腦組織置PBS的培養(yǎng)皿 中，獲得腦葉。懸浮孵育法 培養(yǎng)具體操作如下： 培養(yǎng)基：血漿、199和DEM培養(yǎng)基。 1）拉頸處死13日齡大鼠，消毒，取出肝臟，置于含培養(yǎng)液 的培養(yǎng)皿中。s224。)巨大反響。在貼壁和懸浮培養(yǎng)發(fā)基礎(chǔ)基礎(chǔ)上，融合固定化。如可導(dǎo),第一百一十二頁，共一百一十二頁。ng)總結(jié),第四章 動物細胞與組織培養(yǎng) (Animal Cell and Tissue Culture)。 我國該領(lǐng)域的工作，取得了極有價值成果，我國曹 誼林教授在裸鼠背上復(fù)制人耳，引起國際(gu243。,第一百零九頁，共一百一十二頁。,4.4.5.4 肝臟的培養(yǎng)： 體外培養(yǎng)肝臟在研究肝臟生理病理過程及其機制方面有重大 意義。yǒu)重要意義。 培養(yǎng)基：DMEM，加小牛血清，青、鏈霉素。ngd249。iyǎng)： 軟骨培養(yǎng)常用于研究軟骨與骨的生長分化及影響因 素。陳細華等采用長時間灌流式器官培養(yǎng)方法進行 了草魚腦垂體的完整器官長期培養(yǎng)，82天內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)(fāxi224。)。,4.4.3 傳統(tǒng)的器官(q236。,第九十九頁，共一百一十二頁。ngwěn)、安全，支托或移動大量 的培養(yǎng)器官。n)進行器官培養(yǎng)的方法。jiē)漂浮培養(yǎng)法： 器官浸入培養(yǎng)液中，不能持續(xù)接觸空氣（O2）易 于缺氧壞死。,第九十四頁，共一百一十二頁。)。iyǎng)的特點,成體器官(q236。,第九十頁，共一百一十二頁。iyǎng)概述,器官培養(yǎng)的特征： 器官培養(yǎng)與器官保存、組織培養(yǎng)、細胞培養(yǎng)不同： （1）被培養(yǎng)器官存活較長時間，保持相對正常功 能，器官內(nèi)的細胞有正常功能甚至增殖。 發(fā)展歷史：最早Leob（1897年）進行成年兔一些器官的 嘗試性培養(yǎng)——血漿凝快培養(yǎng)兔的肝、腎、甲狀腺、卵巢等 （3天）；20世紀初器官培養(yǎng)進入活躍時期（主要限于胚胎器 官）；20世紀50年代進入蓬勃發(fā)展階段（不限于胚胎器官）， 技術(shù)、器皿、培養(yǎng)基等有了許多改良和革新。 因材料來源于胚胎組織，所以培養(yǎng)物中還有少量(shǎoli224。 差速處理富集脊髓神經(jīng)元培養(yǎng)法： 材料： 動物：胚齡14天的大鼠胚胎； 培養(yǎng)液：（1）含血清的培養(yǎng)液：DMEM加20%胎 牛血清、50 IU∕ml的青霉素、50μg ∕ml 的鏈霉素 （2）無血清的培養(yǎng)液：DMEM 加5μg ∕ml 牛胰島 素、50 μg ∕ml 人轉(zhuǎn)鐵蛋白。,骨骼肌培養(yǎng)的結(jié)果： 接種數(shù)小時后多數(shù)細胞貼壁，主要為單核（外觀明顯）細 胞；前2天是細胞增殖的主要時期，無明顯細胞融合；50~52 h 后，細胞進入快速融和期；多核細胞快速生長導(dǎo)致纖維網(wǎng)的形 成；數(shù)天后融合結(jié)束，之后可觀察到纖維的自發(fā)收縮現(xiàn)象；再 過1~2天，骨骼肌細胞的特征橫紋開始(kāishǐ)變得明顯；有時肉眼可 見到細胞收縮；適當條件下，細胞增殖一代時間為11~13 h。肌肉受傷后，肌衛(wèi)細胞分裂，轉(zhuǎn)化 為肌細胞，進一步分化為肌纖維，填補受傷部位。 肌肉組織培養(yǎng)：肌肉組織植快或分散的肌細胞在離體環(huán)境中 存活、生長或發(fā)育。,第七十九頁，共一百一十二頁。 3T3細胞培養(yǎng)液：DMEM加10%胎牛血清、4 mmol∕L谷 氨酰胺、青霉素100 IU∕ml、鏈霉素100 μg ∕ml。j236。ngp237。 正在實驗室里生長(shēngzhǎng)成形的：肝臟、胰臟、心臟 乳房、手指、耳朵等。,第七十二頁，共一百一十二頁。bāo)種植和吸附在一種生物材料的支架上進行人工培養(yǎng)、繁殖、擴增，然后移植到人體內(nèi)所需要的部位，從而達到器官修復(fù)或再造的治療目的的一種技術(shù)。 2.開發(fā)高密度生長、大量分泌目標產(chǎn)品的細胞系。 3.培養(yǎng)基、培養(yǎng)設(shè)備以及培養(yǎng)用微載體很昂貴。d236。無血清培養(yǎng)基：避免了血清的批次、質(zhì) 量、成分等對細胞培養(yǎng)的污染、毒性作用、不利于產(chǎn) 品純化等不良影響。 bel2基因的過量表達：能抑制Gln或缺氧引起的細 胞調(diào)亡、減少細胞特定成分的消耗、提高細胞密度(m236。nj236。應(yīng)通過控制供氣參數(shù)，平衡氧的輸送及CO2的去除，防 止生物反應(yīng)器運轉(zhuǎn)中CO2的積累。高濃度乳酸→抑制乳酸脫氫酶 （LDH）活性→減少乳酸產(chǎn)生→阻止NAD的再生和丙酮酸∕乳 酸轉(zhuǎn)換→NADH 增加→抑制糖酵解、低濃度丙酮酸、Gln消耗 減少→產(chǎn)能減少→抑制生長。nj236。,4.2.7 動物細胞生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)(p233。動物細胞的內(nèi)環(huán)境與植物微生物細胞全然不同。但其結(jié)構(gòu)形式仍以攪拌式、氣 升式、固定床為主。i)方法,5. 油浴復(fù)相乳液分離法：油溶性成孔材料K劇烈攪拌 乳化分散到成球材料 P 的水溶液中→水包油型小液滴 →在分散到油性物質(zhì)O中→復(fù)相油滴→溶劑N（與水混 溶但不溶解P）吸出液滴中的水分→硬化成固體小球(xiǎo qi,第五十五頁，共一百一十二頁。i)方法不同。itǐ)的制備,成球材料(c225。,第五十一頁，共一百一十二頁。 現(xiàn)在已開發(fā)出硅膠、聚砜、聚丙烯等的空心纖維。微囊材料：海藻酸（1,4鍵連接的多 聚甘露糖醛酸和古羅糖醛酸）、多聚賴氨酸。)穩(wěn)定性； 5. 最大的比表面積、 6.適合細胞生長的形狀和??； 7. 粒徑分布均一； 8. 能高壓滅菌；,9. 可重復(fù)利用，易于清洗； 10. 保護細胞(x236。uz224。iyǎng)技術(shù),少數(shù)動物細胞屬于懸浮生長型，離體培養(yǎng)時 不需附著物，只需懸浮于培養(yǎng)液中就可以(kěyǐ)良好 生長。)方法。優(yōu)點：避免 培養(yǎng)瓶表面粗糙對培養(yǎng)物的影響；方便染色觀察(guānch225。 特點：液體可循環(huán)供應(yīng)。 缺點：旋轉(zhuǎn)管不易在顯微鏡下觀察。ntǒng)技術(shù)（1907年Harrison創(chuàng)立）。,第三十七頁，共一百一十二頁。 （4）微載體：天然葡聚糖和其他天然或合成聚合物,第三十六頁，共一百一十二頁。,4.2.4 貼壁培養(yǎng)技術(shù)(j236。ngw249。 （2）促生長因子與激素： （3）酶抑制劑：如大豆(d224。在基礎(chǔ)理論研究中 血清的使用影響實驗結(jié)果（原因與結(jié)果難以對應(yīng)）。 （1）基本培養(yǎng)基（essential medium）：人工合成 的只能使體外培養(yǎng)細胞短暫生存（添加天然培養(yǎng)基后 細胞才能繁殖）的培養(yǎng)基。 （4）水解乳蛋白：氨基酸含量高。各有特點。 氣體：容器空間中O2和CO2細胞代謝的進行。,4.2.2 培養(yǎng)(p233。)生長期,穩(wěn)定期,衰亡(shuāiw225。 細胞數(shù)不增加(zēngjiā)，但代謝還是活躍的。,第二十一頁，共一百一十二頁。n d224。ng)。 細胞：移動活躍、分裂但不旺盛、相似(xiānɡ s236。,4.1.6 體外培養(yǎng)細胞的生長(shēngzhǎng)與增殖過程,、細胞系的生長過程： 培養(yǎng)(p233。,第十五頁，共一百一十二頁。bāo)（suspend cell）,此類細胞體外生長不必貼壁，可在培養(yǎng)液中 懸浮生長。 如神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞,第十二頁，共一百一十二頁。外形不規(guī)則。,第十頁，共一百一十二頁。bāo)(anchoragedependent cell),哺乳動物大多數(shù)細胞必須附著固體表面生長。,4.1.4體外培養(yǎng)(p233。 5.原代細胞一般繁殖50代左右即退化死亡。 4.中間連接： 無橫隔、透明，間隔2030nm。 隨著基因重組和單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展，動物 細胞組織培養(yǎng)展現(xiàn)出越來越可觀(kěguān)的工業(yè)化前景。 20世紀80年代以后： 隨著基因工程技術(shù)(j236。,第一頁，共一百一十二頁。 是動物細胞工程的重要技術(shù)基礎(chǔ)：細胞融合、組織 工程、胚胎工程、干細胞工程、動物克隆、動物細胞 產(chǎn)品的大規(guī)模制備技術(shù)等等都離不開～。,4. 1.1 發(fā)展(fāzhǎn)歷史,20世紀40年代以后： 動物組織培養(yǎng)的科學家們研究重點集中在培養(yǎng) 基方面。雜交瘤細胞能在體外懸浮情況下大 量繁殖并產(chǎn)生單克隆抗體。)。 4.動物細胞間主要以聚集體形式存在。,第八頁，共一百一十二頁。,貼附型細胞(x236。 起源于中胚層的細胞在體外培養(yǎng)時一般表現(xiàn)為這種形式。 3. 游走型細胞(wandering)： 類似巨噬細胞樣的特征。 細胞胞體略呈多角形；細胞胞突細長形；類 似絲狀偽足。bāo)或懸浮型細胞(x236。u zhě)活動）、成纖維細胞生 長因子（減少3T3細胞的扁平度）。,第十六頁，共一百一十二頁。1~4周。,4.1.6.1 細胞系的生長(shēngzhǎng)過程：,衰亡期（senescence phase）：細胞仍生存，但 不增殖或增殖很慢，最后衰退死亡(sǐw225。ng)培養(yǎng),第一次傳代(chu225。初代MI 低，傳代和腫瘤細胞系MI高達3~5% 。bāo)的生長過程,穩(wěn)定期（stationary phase）：因培養(yǎng)空間和營 養(yǎng)物質(zhì)有限，特別是代謝廢物的累積，細胞進入：新 分裂的細胞數(shù)與死亡的細胞數(shù)相等的動態(tài)平衡時期。 sh249。,第二十六頁，共一百一十二頁。 pH：最適7.2~7.4，低于高于7.6影響生長甚 至死亡。 （1）血清：主要為牛（胎牛、新生牛、小牛）、 馬、雞、兔、羊、人血清。 （3）雞胚浸出液：含生長因子、核蛋白、氨基 酸等，刺激細胞生長。 使用時需加天然培養(yǎng)基。不需添加血清就可維持體外細胞 較長時間生長繁殖的合成培養(yǎng)基。 FN促進中胚層源細胞的貼壁和分化； LN作用于 內(nèi)皮細胞和內(nèi)胚層源細胞。iyǎng)技術(shù),4.2.3.1 原代培養(yǎng) 組織塊培養(yǎng) 處死動物(d242。 2.酶消化的方法和細胞對酶的反應(yīng)：敏感/遲鈍 （酶作用時間和方法，細胞的類型和來源）,第三十五頁，共一百一十二頁。 （3）金屬：不銹鋼和肽。 退化期：細胞長滿培養(yǎng)瓶壁達一定密度，隨著營 養(yǎng)物的消耗和代謝物的積累，