五種玻璃化凍存試劑單獨(dú)或組合應(yīng)用對(duì)髓核細(xì)胞的毒性分析報(bào)告(存儲(chǔ)版)
【正文】 移液管將各孔的培養(yǎng)液緩慢吸出后注入100 μL DMEMF12。 FDA/PI染色細(xì)胞存活率檢測(cè) 將第2代髓核細(xì)胞制成懸液，以1108 L1的細(xì)胞濃度接種于6孔板中的蓋 ABCDEF50 μm50 μm50 μm50 μm50 μm50 μm圖1 五種單一凍存試劑處理的髓核細(xì)胞FDA/PI染色結(jié)果(標(biāo)尺=50 μm)Figure 1 Fluorescein diacetate/propidium iodide staining of the nucleus pulposus cells after treatment with five monly used cryoprotectants alone (scale bars=50 μm)圖注：圖AF分別為乙二醇組、丙三醇組、甲酰胺組、二甲基亞砜組、丙二醇組、對(duì)照組中髓核細(xì)胞FDA/PI染色結(jié)果，綠色為FDA所染，代表活細(xì)胞；紅色為PI所染，代表細(xì)胞膜受損的細(xì)胞及死細(xì)胞。③CCK8細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果。CCK8檢測(cè)結(jié)果中，單一凍存試劑，2種凍存試劑組合，3種凍存試劑組合及對(duì)照組髓核細(xì)胞活性比較，細(xì)胞活性從大到小依次為乙二醇、丙三醇、甲酰胺、二甲基亞砜、丙二醇。所以，探索椎間盤(pán)的玻璃化長(zhǎng)期保存方法，建立一個(gè)椎間盤(pán)組織庫(kù)，將有助于同種異體椎間盤(pán)移植治療的開(kāi)展。此次實(shí)驗(yàn)中對(duì)5種最常用的玻璃化凍存試劑及其組合試劑對(duì)髓核細(xì)胞的毒性進(jìn)行了排序，在圖1和圖2中可見(jiàn)兩種檢測(cè)方法得出了的結(jié)果基本一致，5種單一玻璃化凍存試劑中，毒性最小的為乙二醇，10組2CPAs中，毒性最小的為乙二醇和丙三醇組合溶液；10組3CPAs混合試劑中，毒性最小的同樣為包含乙二醇和丙三醇的組合溶液。②細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞自然凋亡。利益沖突：所有作者共同認(rèn)可文章有無(wú)相關(guān)利益沖突。 70(1): 3237.[2] Pyne DG, Liu J, Abdelgawad M, et microfluidic processing of mammalian embryos for vitrification. PLoS 。1257: 399421.[9] MarcoJim233。vitrificationcartilage. Cryobiology. 2010。 71(3):367373.[20] Jomha NM, Weiss AD, Fraser Forbes J, et al. Cryoprotectant agent toxicity in porcine articular chondrocytes. 。5:9271.1. 若不給自己設(shè)限，則人生中就沒(méi)有限制你發(fā)揮的藩籬。歲月是有情的，假如你奉獻(xiàn)給她的是一些色彩，它奉獻(xiàn)給你的也是一些色彩。努力過(guò)后，才知道許多事情，堅(jiān)持堅(jiān)持，就過(guò)來(lái)了。vitrificationovarianporcine4(6 Suppl): 209s218s.[14] Dong L, Tan MS, Yan QH, et mismatch of cervical disc prostheses with Chinese cervical anatomic dimensions. Chin Med J (Engl).2015；128(2): 197202.[15] Luk KD, Ruan DK..Intervertebral disc transplantation: a biological approach to motion preservation. Eur Spine 。30(6):613621.[7] Maehara M, Sato M, Watanabe M, et of a novel vitrification method for chondrocyte sheets. BMC 。文章版權(quán)：文章出版前雜志已與全體作者授權(quán)人簽署了版權(quán)相關(guān)協(xié)議。作者貢獻(xiàn)：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為胡成棟、李建國(guó)；實(shí)驗(yàn)實(shí)施為所有作者；實(shí)驗(yàn)評(píng)估為李盼、尹合勇；資料收集為劉曦、周玉軍、李海濤、李彥飛、王飛。另外，雖然二甲基亞砜為目前最常用的凍存試劑，但是在實(shí)驗(yàn)中其對(duì)髓核毒性卻不是最小的，所以如果因?qū)嶒?yàn)需要而使用其他毒性較大的玻璃化凍存試劑(如二甲基亞砜、甲酰胺、丙二醇)，可將乙二醇(和)或丙三醇與其混合以減小其對(duì)髓核細(xì)胞的毒性。PI不能穿透正常細(xì)胞的細(xì)胞膜，但是可穿透受損細(xì)胞或死細(xì)胞的細(xì)胞膜從而與其DNA或RNA相互作用使得受損細(xì)胞顯示紅色熒光，因此，具有完整細(xì)胞膜的細(xì)胞呈現(xiàn)綠色，細(xì)胞膜損傷者則顯示為紅色。人工椎間盤(pán)置換可維持脊柱穩(wěn)定性，保留相應(yīng)節(jié)段脊柱的運(yùn)動(dòng)，但是研究表明，人工椎間盤(pán)置換可以使脊柱運(yùn)動(dòng)方式發(fā)生永久改變，導(dǎo)致相鄰節(jié)段椎體不穩(wěn)以及壓力增加，同樣可加速鄰近節(jié)段退變[13]，并且存在假體松動(dòng)，下沉，磨損，自發(fā)融合等一系列問(wèn)題[14]。FDA/PI染色結(jié)果中，單一凍存試劑，2種凍存試劑組合，3種凍存試劑組合及對(duì)照組細(xì)胞存活率比較，20種凍存試劑中包含有乙二醇(或)丙三醇的組合玻璃化凍存試劑處理過(guò)的髓核細(xì)胞存活率較高。細(xì)胞活性(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值空白對(duì)照A值/對(duì)照組A值空白對(duì)照A值)100% 主要觀察指標(biāo) ①FDA/PI染色結(jié)果。同樣為防止移出玻璃化凍存試劑對(duì)細(xì)胞滲透壓產(chǎn)生較大影響，采用階梯式緩慢移出的方法。選擇玻璃化凍存組織和細(xì)胞所需要的玻璃化凍存試劑濃度(約8 mol/L)，2CPA中玻璃化凍存試劑濃度比例為1∶1，3CPA中玻璃化凍存試劑濃度比例為1∶1∶1。 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡健康雄性新西蘭大白兔10只，由解放軍總醫(yī)院動(dòng)物中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：scxk(京)20100001。 Drug ToxicityFunding: Handan Science and Technology Research and Development Project, No. 0928108052Cite this article: Li JG, Li P, Yin HY, Liu X, Zhou YJ, Li HT, Li YF, Wang F, Hu CD. Five kinds of vitrified cryoprotectants: toxicity of their alone or bination to nucleus pulposus cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016。③組合試劑中，含有乙二醇或丙三醇的2種凍存試劑組合或3種凍存試劑組合毒性均較小。髓核：髓核為椎間盤(pán)結(jié)構(gòu)的一部分，位于兩軟骨板與纖維環(huán)之間，是乳白色半透明膠狀體，富于彈性，由縱橫交錯(cuò)的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)即軟骨細(xì)胞和蛋白多糖黏液樣基質(zhì)構(gòu)成的彈性膠凍物質(zhì)。方法：選取目前最常用的5種玻璃化凍存試劑：二甲基亞砜、甲酰胺、乙二醇、丙二醇、丙三醇，采用單一5種、任意2種及任意3種玻璃化凍存試劑互相組合成各10種凍存試劑組合共25種。 2Second Department of Orthopedics, Handan Central Hospital, Handan 056001, Hebei Province, China。而慢速冷凍法采用分步降溫，操作復(fù)雜，且凍存過(guò)程中產(chǎn)生冰晶較多，容易損傷細(xì)胞。用尖刀劃開(kāi)胸1椎間盤(pán)前方纖維環(huán)，彎折相鄰椎體顯露間隙后可見(jiàn)椎間盤(pán)中膠凍狀髓核附著于纖維環(huán)上，用眼科鑷將髓核組織移至盛有DMEMF12培養(yǎng)皿中，其余節(jié)段髓核組織依次取出。為防止加入過(guò)高濃度玻璃化凍存試劑對(duì)細(xì)胞滲透壓產(chǎn)生較大影響，采取階梯式加入方法。玻片上，37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜，實(shí)驗(yàn)組各孔用階梯式加入法緩慢加入相應(yīng)的玻璃化凍存試劑使其濃度達(dá)到8 mol/L
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