【正文】 移液管將各孔的培養(yǎng)液緩慢吸出后注入100 μL DMEMF12。 FDA/PI染色細胞存活率檢測 將第2代髓核細胞制成懸液，以1108 L1的細胞濃度接種于6孔板中的蓋 ABCDEF50 μm50 μm50 μm50 μm50 μm50 μm圖1 五種單一凍存試劑處理的髓核細胞FDA/PI染色結(jié)果(標尺=50 μm)Figure 1 Fluorescein diacetate/propidium iodide staining of the nucleus pulposus cells after treatment with five monly used cryoprotectants alone (scale bars=50 μm)圖注：圖AF分別為乙二醇組、丙三醇組、甲酰胺組、二甲基亞砜組、丙二醇組、對照組中髓核細胞FDA/PI染色結(jié)果，綠色為FDA所染，代表活細胞；紅色為PI所染，代表細胞膜受損的細胞及死細胞。③CCK8細胞活性檢測結(jié)果。CCK8檢測結(jié)果中，單一凍存試劑，2種凍存試劑組合，3種凍存試劑組合及對照組髓核細胞活性比較，細胞活性從大到小依次為乙二醇、丙三醇、甲酰胺、二甲基亞砜、丙二醇。所以，探索椎間盤的玻璃化長期保存方法，建立一個椎間盤組織庫，將有助于同種異體椎間盤移植治療的開展。此次實驗中對5種最常用的玻璃化凍存試劑及其組合試劑對髓核細胞的毒性進行了排序，在圖1和圖2中可見兩種檢測方法得出了的結(jié)果基本一致，5種單一玻璃化凍存試劑中，毒性最小的為乙二醇，10組2CPAs中，毒性最小的為乙二醇和丙三醇組合溶液；10組3CPAs混合試劑中，毒性最小的同樣為包含乙二醇和丙三醇的組合溶液。②細胞培養(yǎng)過程中細胞自然凋亡。利益沖突：所有作者共同認可文章有無相關(guān)利益沖突。 70(1): 3237.[2] Pyne DG, Liu J, Abdelgawad M, et microfluidic processing of mammalian embryos for vitrification. PLoS 。1257: 399421.[9] MarcoJim233。vitrificationcartilage. Cryobiology. 2010。 71(3):367373.[20] Jomha NM, Weiss AD, Fraser Forbes J, et al. Cryoprotectant agent toxicity in porcine articular chondrocytes. 。5:9271.1. 若不給自己設(shè)限，則人生中就沒有限制你發(fā)揮的藩籬。歲月是有情的，假如你奉獻給她的是一些色彩，它奉獻給你的也是一些色彩。努力過后，才知道許多事情，堅持堅持，就過來了。vitrificationovarianporcine4(6 Suppl): 209s218s.[14] Dong L, Tan MS, Yan QH, et mismatch of cervical disc prostheses with Chinese cervical anatomic dimensions. Chin Med J (Engl).2015；128(2): 197202.[15] Luk KD, Ruan DK..Intervertebral disc transplantation: a biological approach to motion preservation. Eur Spine 。30(6):613621.[7] Maehara M, Sato M, Watanabe M, et of a novel vitrification method for chondrocyte sheets. BMC 。文章版權(quán)：文章出版前雜志已與全體作者授權(quán)人簽署了版權(quán)相關(guān)協(xié)議。作者貢獻：實驗設(shè)計為胡成棟、李建國；實驗實施為所有作者；實驗評估為李盼、尹合勇；資料收集為劉曦、周玉軍、李海濤、李彥飛、王飛。另外，雖然二甲基亞砜為目前最常用的凍存試劑，但是在實驗中其對髓核毒性卻不是最小的，所以如果因?qū)嶒炐枰褂闷渌拘暂^大的玻璃化凍存試劑(如二甲基亞砜、甲酰胺、丙二醇)，可將乙二醇(和)或丙三醇與其混合以減小其對髓核細胞的毒性。PI不能穿透正常細胞的細胞膜，但是可穿透受損細胞或死細胞的細胞膜從而與其DNA或RNA相互作用使得受損細胞顯示紅色熒光，因此，具有完整細胞膜的細胞呈現(xiàn)綠色，細胞膜損傷者則顯示為紅色。人工椎間盤置換可維持脊柱穩(wěn)定性，保留相應節(jié)段脊柱的運動，但是研究表明，人工椎間盤置換可以使脊柱運動方式發(fā)生永久改變，導致相鄰節(jié)段椎體不穩(wěn)以及壓力增加，同樣可加速鄰近節(jié)段退變[13]，并且存在假體松動，下沉，磨損，自發(fā)融合等一系列問題[14]。FDA/PI染色結(jié)果中，單一凍存試劑，2種凍存試劑組合，3種凍存試劑組合及對照組細胞存活率比較，20種凍存試劑中包含有乙二醇(或)丙三醇的組合玻璃化凍存試劑處理過的髓核細胞存活率較高。細胞活性(%)=(實驗組A值空白對照A值/對照組A值空白對照A值)100% 主要觀察指標 ①FDA/PI染色結(jié)果。同樣為防止移出玻璃化凍存試劑對細胞滲透壓產(chǎn)生較大影響，采用階梯式緩慢移出的方法。選擇玻璃化凍存組織和細胞所需要的玻璃化凍存試劑濃度(約8 mol/L)，2CPA中玻璃化凍存試劑濃度比例為1∶1，3CPA中玻璃化凍存試劑濃度比例為1∶1∶1。 材料 實驗動物 8周齡健康雄性新西蘭大白兔10只，由解放軍總醫(yī)院動物中心提供，動物質(zhì)量合格證號：scxk(京)20100001。 Drug ToxicityFunding: Handan Science and Technology Research and Development Project, No. 0928108052Cite this article: Li JG, Li P, Yin HY, Liu X, Zhou YJ, Li HT, Li YF, Wang F, Hu CD. Five kinds of vitrified cryoprotectants: toxicity of their alone or bination to nucleus pulposus cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016。③組合試劑中，含有乙二醇或丙三醇的2種凍存試劑組合或3種凍存試劑組合毒性均較小。髓核：髓核為椎間盤結(jié)構(gòu)的一部分，位于兩軟骨板與纖維環(huán)之間，是乳白色半透明膠狀體，富于彈性，由縱橫交錯的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)即軟骨細胞和蛋白多糖黏液樣基質(zhì)構(gòu)成的彈性膠凍物質(zhì)。方法：選取目前最常用的5種玻璃化凍存試劑：二甲基亞砜、甲酰胺、乙二醇、丙二醇、丙三醇，采用單一5種、任意2種及任意3種玻璃化凍存試劑互相組合成各10種凍存試劑組合共25種。 2Second Department of Orthopedics, Handan Central Hospital, Handan 056001, Hebei Province, China。而慢速冷凍法采用分步降溫，操作復雜，且凍存過程中產(chǎn)生冰晶較多，容易損傷細胞。用尖刀劃開胸1椎間盤前方纖維環(huán)，彎折相鄰椎體顯露間隙后可見椎間盤中膠凍狀髓核附著于纖維環(huán)上，用眼科鑷將髓核組織移至盛有DMEMF12培養(yǎng)皿中，其余節(jié)段髓核組織依次取出。為防止加入過高濃度玻璃化凍存試劑對細胞滲透壓產(chǎn)生較大影響，采取階梯式加入方法。玻片上，37 ℃，體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜，實驗組各孔用階梯式加入法緩慢加入相應的玻璃化凍存試劑使其濃度達到8 mol/L