酯酶與氧化酶ppt課件(存儲(chǔ)版)
【正文】 （一）顯示方法 —— 硫化鉛法（吐溫法之一， Gomori,1954) １、基本原理 以長(zhǎng)鏈脂肪酸酯為底物，在脂酶作用下，分離出的脂肪酸可與鈣形成鈣皂沉淀，再用鉛置換鈣，最后經(jīng)硫化胺置換生成棕黑色硫化鉛沉淀。 胰腺 最為豐富，其次是 肝臟、腎臟、脾臟 、唾液腺導(dǎo)管 （但大鼠極少）、胃賁門、睪丸基質(zhì)細(xì)胞中也存在。 氧化劑： 受電子體（或受氫體 )Fe3+(高鐵離子）。 N A D H F M N ( F e S) C oQ C y t b C y t c1C y t c C y t a a 3 O2 H 2 O[ ] [ ]N A D H C oQ 還原酶 C oQC y t C 還原酶細(xì)胞色素氧化酶電子傳遞鏈二、細(xì)胞色素氧化酶 (Cytochrome Oxidase, CCO) 細(xì)胞色素 (Cytochrome, cyt)是生物細(xì)胞內(nèi)一類傳遞蛋白質(zhì)，含有鐵呋啉輔基，具有紅色而取名細(xì)胞色素。 2. 二氨基聯(lián)苯胺法 （ DAB法 , diaminobenzidine） 原理 細(xì)胞色素氧化酶（ CCO）能催化 DAB，被 H2O2氧化，在新鮮或固定標(biāo)本上生成 棕色沉淀。 DAB將氧化型細(xì)胞色素Ｃ還原，還原型細(xì)胞色素Ｃ又被細(xì)胞色素 a再氧化，反復(fù)循環(huán)進(jìn)行，DAB不斷被氧化，反應(yīng)氧化物沉淀沉積。 孵育液 ，溶于 酸緩沖液中， 。 四、單胺氧化酶 (Monoamine Oxidase, MAO) 又稱腎上腺素氧化酶，酪胺酶。 4. 結(jié)果 酶反應(yīng)陽性部位見藍(lán)色或紫色甲簪顆粒。 六、輔酶依賴性脫氫酶－乳酸脫氫酶 （ Lactate dehydrogenase, LDH) 反應(yīng)原理 從反應(yīng)生成的 NADH，通過受氫體 PMS（吩嗪硫酸甲脂）供給四唑鹽，將其還原為甲簪。 酶組化小結(jié) 分類、條件、基本方法、影響酶活性的條件 磷酸酶金屬法、偶聯(lián)法原理、步驟及意義 ATP酶的分類與顯示方法 非特異性酯酶、特異性酯酶顯示方法及原理 細(xì)胞色素氧化酶和乳酸脫氫酶原理與方法 。 5. 對(duì)照 (1)去琥珀酸底物； (2)加 SDH競(jìng)爭(zhēng)性抑制； (3)加熱使細(xì)胞內(nèi)酶失活。 CN NN NC L++ 2 HNNNNHC + H C L四唑鹽（無色） + H還原甲簪沉淀（藍(lán)紫色）HRP 2. 孵育液 —— 四唑鹽法 鹽酸色胺（底物） 25mg 無水硫酸鈉 4mg NBT（四唑鹽） 4mg () 5ml 蒸餾水 15ml 3. 操作步驟 (1)新鮮冰凍切片； (2)入孵育液， 37℃ 30 60min； (3)流水沖洗 2min； (4)4%多聚甲醛固定 24h。 4. 結(jié)果 酶活性部位呈 黑棕色顆粒 。 三、 DOPA氧化酶 (Catechol Oxidase) 也稱兒茶酚氧化酶，酪氨酸酶。抑制劑為氰化物、迭氮化鈉（ NaN3）、硫化氫（ H2S）、一氧化碳，原因是這些物質(zhì)均能與細(xì)胞色素氧化酶的三價(jià)鐵結(jié)合而抑制酶活性。 （ 4）結(jié)果： 酶活性部位呈棕黑色顆粒。代謝物脫下一對(duì)氫，分別以 NADH + H+或 FADH2進(jìn)入 電子傳遞鏈 ，最終與 氧結(jié)合生成水 ，并釋放能量。 還原反應(yīng)： 合成代謝 中得電子、加氫、脫氧。 脂肪細(xì)胞也需要脂酶水解脂肪 ， 以保證脂肪的外運(yùn) 。 六、脂酶 (Lipase) 脂酶又名甘油酯水解酶，能催化 長(zhǎng)鏈脂肪酸甘油酯 或其它 醇酯 水解。 輔酶 A被游離出來 ，輔酶 A中的 — SH被鉛離子沉淀而顯示酶的活性 。在細(xì)胞水平發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)所用的各類細(xì)胞，正常狀態(tài)沒有 AChE活性反應(yīng)，一旦發(fā)生凋亡，都有 AChE活性反應(yīng)。 ３、操作步驟 (1) 新鮮組織恒冷箱切片； (2)冷丙酮或 10%福爾馬林固定 2025min； (3)蒸餾水洗； (4)入孵育液 37℃ ，１ h； (5)蒸餾水洗； (6)甘油明膠封固。 極強(qiáng)陽性： 胰腺 外分泌部腺細(xì)胞 ，橫紋肌 運(yùn)動(dòng)終板 ， 小腸 上皮 細(xì)胞； 強(qiáng)陽性： 肝細(xì)胞， 腎近曲小管上皮 ，結(jié)腸上皮細(xì)胞； 陽性：胰腺和腮腺導(dǎo)管上皮，食管上皮，腸腺上皮，肺泡 巨噬細(xì)胞，睪丸間質(zhì)細(xì)胞。 NO C O RH+ H 2 OHNO H+ R C O O H酯酶吲哚酚酯 吲哚酚 羧酸 + 六氮鹽 偶氮色素 2. 孵育液 醋酸吲哚酚 3mg 二甲基甲酰胺 六氮化副薔薇苯胺緩沖液 10ml （ 六氮化副薔薇苯胺 [pH56],用 1mol/，混勻過濾立即使用。 三、非特異性酯酶 O C OC H3C O N H C 6 H 5酯酶C OO HC6H5N H+ C H3C O O H萘酚 A S 醋酸萘酚 A S乙酸C OO HC6H5N H+萘酚 A SN HC OC LO C H3N N C LNO C H3C LC ON HNN H C6H5O HC O可林思 L B 鹽偶氮色素2. 孵育液 （萘酚 AS乙酸酯法 Pearse,1972） 1%萘酚 AS醋酸鹽（丙酮溶液） (底物） (pH ) 10ml（緩沖液） 堅(jiān)牢藍(lán) B鹽 30mg（重氮鹽） 攪拌過濾使用 3. 操作步驟 (1)新鮮組織恒冷箱切片； (2)入孵液，室溫或 37℃ 20 30min； (3)流水沖洗 2min； (4)2%甲基綠 復(fù)染細(xì)胞核； (5)流水沖洗 35min； (6)甘油明膠封固。特異性酯酶據(jù)其底物特異性可分為，分解 長(zhǎng)鏈 (C8以上）高級(jí)脂肪酸酯 的酶稱 酯酶 (Lipase)， 分解乙酰膽堿的 乙酰膽堿酯酶 ，分解酯酰膽堿的 膽堿酯酶 。Esterase 一、基本概念 1. 定義： 酯酶 (Esterase), 催化作用于酯類物質(zhì)的酯健 ,使之水解
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